Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Özet

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Özet

Aksonal taşıma, aksonal proteinleri nöronal hücre gövdesindeki sentez bölgelerinden aksondaki hedeflerine ulaştırmak için bir ön koşuldur. Sonuç olarak, aksonal taşıma kaybı nöronal büyümeyi ve fonksiyonu bozar. Aksonal taşımayı incelemek bu nedenle nöronal hücre biyolojisi anlayışımızı geliştirir. CRISPR Cas9 genom düzenlemesindeki son gelişmelerle, aksonal kargoların endojen etiketlemesi erişilebilir hale geldi ve taşımanın ektopik ifade tabanlı görselleştirmesinin ötesine geçilmesini sağladı. Bununla birlikte, endojen etiketleme genellikle düşük sinyal yoğunluğu pahasına gelir ve sağlam veriler elde etmek için optimizasyon stratejileri gerektirir. Burada, yaygın sitoplazmik arka plan üzerinde endojen etiketli kargonun sinyalini iyileştirmek için edinim parametrelerini ve bir ağartma yaklaşımını tartışarak aksonal taşımanın görselleştirilmesini optimize etmek için bir protokol açıklıyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) etiketli RAB-3 ile etiketlenmiş sinaptik vezikül öncülerinin (SVP'ler) görselleştirilmesini optimize etmek için protokolümüzü uyguluyoruz ve ince ayar edinim parametrelerinin Caenorhabditis elegans'ta (C. elegans) endojen olarak etiketlenmiş aksonal yükün analizini nasıl iyileştirebileceğini vurguluyoruz.

Giriş

Yaşam boyunca nöronlar, proteinleri, lipitleri ve diğer molekülleri hücre gövdesinden aksondaki nihai hedeflerine iletmek için aksonal taşımaya güvenir. Sonuç olarak, aksonal transportun bozulması, nöronal fonksiyon kaybı ile ilişkilidir ve sıklıkla nörodejeneratif bozuklukların patolojisinde rol oynar ^1,2. Bu nedenle, aksonal taşımanın altında yatan mekanizmaları anlamak büyük ilgi çekmektedir.

Aksonal taşıma üzerine onlarca yıl süren araştırmalar, bu taşımaya aracılık eden moleküler mekanizmalar, bileşimleri ve düzenleyici mekanizmalar hakkında bi....

Protokol

Canlı hücre görüntüleme için nematodların nasıl korunacağı ve hazırlanacağı hakkında ayrıntılı bir protokol için, S.Niwa ^7'nin çalışmasına bakın.

1. Solucan suşu üretimi

Nematod suşları üretmeye ek olarak, Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)⁸ , doğrudan web sayfalarından elde edilebilen, endojen olarak floresan olarak etiketlenmiş proteinlere sahip, büyüyen bir nematod suşları koleksiyonu içerir.

1. Floresan etiketleme stratejisinin seçimi
   1. DA9 motor nöronunda RAB-3 etiketli endojen GFP'yi görselleştir....

Tartışmalar

Yöntemin sınırlılıkları ve alternatif yöntemler
Bu protokolde, sinaptik vezikül öncüleri ile ilişkili olan endojen olarak etiketlenmiş RAB-3'ün aksonal taşınmasını görselleştirmek için edinim parametrelerini optimize ettik. RAB-3'ü görselleştirmek için, yakın zamanda yayınlanan bir FLIP-on::GFP::RAB-3 suşu^6'yı kullandık ve rekombinaz Flippaze'yi hücreye özgü bir promotör (glr-4p)²⁵ altın.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)