Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Özet

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Özet

Arkeon Sulfolobus acidocaldarius , umut verici bir termofilik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Termofillerin değişen sıcaklıklara nasıl adapte olduklarını araştırmak, yalnızca temel evrimsel süreçleri anlamak için değil, aynı zamanda S. acidocaldarius'u biyomühendislik için bir şasi olarak geliştirmek için de önemli bir gerekliliktir. Termofillerle deneysel evrim yürütmenin önündeki en büyük engellerden biri, yüksek sıcaklıkta büyüme için geleneksel inkübatörlerin ekipman bakımı ve enerji kullanımı masraflarıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, S. acidocaldarius'ta deneysel evrim yürütmek için düşük maliyetli ve enerji açısından verimli tezgah üstü termomikserler kullanan kapsamlı bir deneysel protokol sunulmuştur. Protokol, nispeten küçük hacimli (1.5 mL) bir toplu kültür tekniğini içerir ve birden fazla bağımsız soyda adaptasyonun izlenmesini sağlar. Bu yöntem, ek termomikserler kullanılarak kolayca ölçeklenebilir. Böyle bir yaklaşım, hem ilk yatırımı hem de deneysel araştırmalarla ilişkili devam eden maliyetleri azaltarak S. acidocaldarius'un bir model sistem olarak erişilebilirliğini arttırır. Ayrıca, teknik, çeşitli çevresel koşullara adaptasyonu keşfetmek için diğer mikrobiyal sistemlere aktarılabilir.

Giriş

Dünyadaki erken yaşam, aşırı yüksek sıcaklıklar ve asitlik¹ ile karakterize edilen hidrotermal menfezler gibi aşırı ortamlarda ortaya çıkmış olabilir. Mikroplar, kaplıcalar ve volkanik solfatara da dahil olmak üzere aşırı ortamlarda yaşamaya devam ediyor. Bu aşırı koşullar altında meydana gelen evrimsel dinamikleri karakterize etmek, bu koşullar altında hayatta kalmayı sağlayan özel fizyolojik süreçlere ışık tutabilir. Bunun, biyolojik çeşitliliğin kökenlerini anlamamızdan, biyoteknolojik uygulamalarla yeni yüksek sıcaklık enzimlerinin geliştirilmesine kadar geniş kapsamlı etkileri olabilir.

Protokol

1. S. acidocaldarius büyüme ortamının (BBM ⁺) hazırlanması

NOT: S. acidocaldarius'u yetiştirmek için bu protokol Bazal Brock Ortamı (BBM⁺)²³ kullanır. Bu, öncelikle önceden hazırlanabilecek BBM⁻ oluşturmak için aşağıda özetlenen inorganik stok çözeltilerinin birleştirilmesiyle hazırlanır. BBM⁺ daha sonra organik stok çözeltileri ^BBM'ye eklenerek gerektiği gibi hazırlanır. Stok çözelti tarifleri de Tablo 1'de sunulmuştur. Tüm medya ve stok çözeltileri çift damıtılmış H₂....

Tartışmalar

Bu çalışma, termofiller için deneysel bir evrim protokolü geliştirdi, burada archaeon S. acidocaldarius için uyarlanmış, ancak yüksek sıcaklıkta büyüme gereksinimleri olan diğer mikroplara uyarlanabilir. Bu protokol, başlangıçta mezofilik bakteriler için tasarlanmış teknikler üzerine kuruludur, ancak yüksek sıcaklıkta aerobik büyüme ile ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmek için özel olarak modifiye edilmiştir^.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.