Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini

Özet

Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR'ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.

Özet

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler), önemli hücresel süreçlere katılan protein alanlarıdır. Stres koşulları sırasında, hücresel ortamın fizikokimyasal özellikleri değişir ve IDR'lerin konformasyonel topluluğunu doğrudan etkiler. IDR'ler doğası gereği çevresel bozulmalara karşı hassastır. Hücrenin fizikokimyasal özelliklerinin IDR'lerin konformasyonel topluluğunu nasıl düzenlediğini incelemek, işlevlerinin çevresel kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada, hiperozmotik stres koşullarına yanıt olarak canlı Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR'lerin yapısal duyarlılığını ölçmek için adım adım bir yöntem açıklıyoruz. Herhangi bir ozmolit içeren hücrelere uygulanan hiperozmotik stresin aşamalı bir artışı sırasında IDR'lerin küresel boyutlarının nasıl değiştiğini tahmin etmek için topluluk floresan rezonans enerji transferinin (FRET) kullanımını sunuyoruz. Ek olarak, floresan ölçümlerini işlemek ve farklı IDR'ler için yapısal hassasiyeti karşılaştırmak için bir komut dosyası sağlıyoruz. Araştırmacılar bu yöntemi izleyerek, IDR'lerin değişen ortamlar üzerine karmaşık hücre içi ortamda geçirdikleri konformasyonel değişiklikler hakkında değerli bilgiler edinebilirler.

Giriş

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler) hücresel süreçlerde kritik bileşenlerdir¹. Yapılandırılmış alanlarla kombinasyon halinde, IDR'ler protein fonksiyonları için gereklidir. IDR'lerin amino asit bileşimi önyargılıdır ve esas olarak yüklü, hidrofilik ve küçük kalıntılarla temsil edilir. Bu özellik nedeniyle, IDR'ler düşük karmaşıklık alanları ^2,3 olarak kabul edilir. Çok sayıda IDR, öncelikle bu bölgelerin patolojik durumlarda, özellikle nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli bir rol oynaması nedeniyle dikkat çekmiştir. Bu tür hastalıklar, nöronlarda IDR'lerin kendi kendine toplanması....

Protokol

1. Plazmit yapısı

1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile istenen IDR'yi kodlayan açık okuma çerçevesini (ORF) yükseltin. ORF, floresan proteinleri kodlayan genler tarafından kuşatılacağından durdurma kodonunu dahil etmeyin. Amplifikasyon için, SacI (5') ve BglII (3') kısıtlama bölgelerine sahip primerler tasarlayın.
   NOT: Temsili sonuçlar bölümü için, seçilen IDR olarak AtLEA4-5'i kullandık. AtLEA4-5'in ORF'sini pTrc99A-AtLEA4-5 plazmid^12'den çoğalttık.
2. ORF PCR ürününü SacI ve BglII enzimleri¹³ ile ardışık kısıtlama ile sindirin.
3. Ticari p....

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem, IDR'ler topluluğunun küresel boyutlarının çevresel bozulmaları nasıl algıladığına ve bunlara nasıl tepki verdiğine dair içgörüler elde etmenin bir yolunu sunar. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış bir yapıya dayanır ve maya hücrelerinde plazmit stabil ekspresyonunun ötesinde hiçbir ek bileşen gerektirmez, bu da onu diğer hücre tiplerindeki potansiyel uygulamalar için uyarlanabilir hale getirir. Ayrıca, ökaryotik hücrelerin yaşam döngüleri boyunca yaşadıkları di.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500