Bir Murin Modelinde Glioblastomun İki Fotonlu İntravital Mikroskobu

Özet

Bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin glioblastoma tümör iletiminin iki foton mikroskobu için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

İntravenöz olarak uygulanan kanser terapötiklerinin beyin tümörlerine verilmesi, kan-beyin bariyeri ile sınırlıdır. Beyin tümörlerinde makromoleküllerin birikimini ve dağılımını in vivo olarak doğrudan görüntülemek için bir yöntem, klinik öncesi modellerde ilaç dağıtımını anlama ve optimize etme yeteneğimizi büyük ölçüde artıracaktır. Bu protokol, bir fare glioblastoma (GBM) modelinde iki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM) ile intravenöz olarak uygulanan floresan etiketli nanopartiküllerin gerçek zamanlı in vivo takibi için bir yöntemi açıklar.

Protokol, deney hayvanlarının anestezi ve analjezisi, bir kraniyal pencere oluşturma, GBM hücre implantasyonu, bir kafa çubuğu yerleştirme, 2P-IVM çalışmaları yürütme ve uzun süreli takip çalışmaları için cerrahi sonrası bakım dahil olmak üzere prosedürün çok aşamalı bir tanımını içerir. Temsili 2P-IVM görüntüleme seansları ve görüntü analizi gösteriyoruz, bu teknolojinin avantaj ve dezavantajlarını inceliyoruz ve potansiyel uygulamaları tartışıyoruz.

Bu yöntem, in vivo preklinik beyin görüntüleme alanındaki farklı araştırma soruları için kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.

Giriş

İki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM), canlı doku^1'in görüntülenmesini sağlayan bir floresan görüntüleme tekniğidir.

İlk olarak 1990'larda geliştirilen 2P-IVM, çeşitli klinik öncesi modellerde retina², böbrek³, ince bağırsak⁴, koklea⁵, kalp⁶, trakea^{7 ve beynin} in vivo analizi için kullanılmıştır ^8,9. Sinirbilim alanında, 2P-IVM, uyanık hayvanlarda sağlıklı beynin gerçek zamanlı görüntülenmesi için bir teknik olarak^{önem kazanmıştır 10} ve Alzheimer¹¹, Parkinson¹² ve glioblastoma (GBM) gibi sinir sistemi hastalıklarını incelemenin yanı sıra13,14,15,16^.

2P-IVM, GBM'nin gelişimi sırasında tümör mikroçevresini incelemek için zarif bir çözüm sunar. Daha önceki bazı çalışmalar in vitro¹⁷ ve ex vivo modeller^18'e odaklanırken, diğerleri GBM'yi incelemek için ortotopik¹⁹ ve ksenotropik²⁰ in vivo modelleri uyguladı. Madden ve ark. bir fare modelinde CNS-1 sıçan glioma hücre hattının doğal görüntülemesini gerçekleştirdi¹³. Ortotopik bir GL261-DsRed murin modeli kullanarak, Ricard ve ark. 2P-IVM^14'te tümör bölgesindeki kan damarlarını geliştirmek için intravenöz bir florofor uygulaması gerçekleştirdi.

Burada, GBM'nin ortotopik bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin (NP) tümör iletimini izlemek için 2P-IVM uyguluyoruz. Bir kraniyal pencere kullanarak, bu yöntem beyindeki NP'lerin gerçek zamanlı uzay-zamansal dağılımını ayrıntılı olarak incelememizi sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokolde açıklanan hayvan prosedürü, Laboratuvar Hayvanları Bakımı İdari Paneli'nin (APLAC) gerekliliklerine uygundur.

1. Hücre kültürü

1. Davlumbazın hazırlanması
   1. Ellerinizi yıkayın, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Biyolojik güvenlik kabinini açın ve kanat seviyesini uygun bir açılma yüksekliğine ayarlayın. Davlumbazın 3-5 dakika kurumasına izin verin. Davlumbaz bölgesine %70 etanol püskürtün ve kağıt mendille silin.
   2. Tüm reaktifleri% 70 etanol ile püskürtün ve kağıt mendille silin. Reaktifleri kaputun içine taşıyın. Izgaraya herhangi bir eşya koymayın. Davlumbazda bir dökülme meydana gelirse, mendille örtün,% 70 etanol püskürtün ve tekrar silin.
   3. Deneyden sonra, her bir öğenin kapaklarını dikkatlice kapatın, tüm malzemeleri silin, tüm öğeleri başlıktan çıkarın ve orijinal konumlarına aktarın. Davlumbaza% 70 etanol püskürtün ve silin. Kanadı kapatın ve biyolojik güvenlik kabinini kapatın.
2. Bir büyüme ortamının hazırlanması
   1. 500 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'una (DMEM) 50 mL% 100 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 5 mL antibiyotik-antimikotik solüsyon (100x) ekleyin.
   2. Tüm reaktifleri steril bir 500 mL filtreleme şişesinden (0.22 μm filtre) geçirin.
3. Dondurularak saklanmış hücrelerin çözülmesi
   1. Bir laminer akış başlığında, bir T75 şişesine 20 mL büyüme ortamı ekleyin. Şişeyi, şişedeki hücrelerin adı, tarih ve geçiş numarası ile etiketleyin. Bu çalışmada yapışık C6 glioma hücreleri kullanıldı.
   2. Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Hücreleri girdaplamayın. Hücreleri çözün ve hemen kullanın.
   3. Çözülmüş hücreleri 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak T75 şişesine aktarın. Transfer işlemi sırasında herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin ve şişenin boynunda herhangi bir orta kalıntı bırakmayın. Bu, olası kontaminasyon riskini artırabilir.
4. Ortamı değiştirme
   1. Kalıntı tripsin veya dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için çözülmeyi takip eden gün ortamı değiştirin (adım 1.6). Daha sonra, hücre birleşme seviyesine bağlı olarak ortamı haftada en az iki kez veya daha fazla değiştirin. Tripsini ortadan kaldırmak için ortam, geçişten bir gün sonra değiştirilmelidir.
   2. Ortamı değiştirmek için aspirasyon aparatını açın, aspirasyon camı pipetini takın ve tüm ortamı aspire edin.
   3. Büyüme ortamının 20 mL'sini ekleyin (adım 1.2).
5. Hücrelerin geçirilmesi
   1. Kaputu deney sırasında ihtiyaç duyulan eşyalarla doldurun.
   2. Bir aspirasyon cam pipeti kullanın ve cam pipetin şişenin hücre olmayan tarafında olduğundan emin olarak tüm ortamı aspire edin. Bu adım için T75 şişesini dikey olarak konumlandırın.
   3. Hücre dışı tarafa ~ 10 mL oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu salin (PBS, Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ içermez) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS, Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ içermez) ekleyin. T75 şişesini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde yatay olarak konumlandırarak hücreleri PBS ile kısa bir süre yıkayın.
   4. Şişeyi hemen dikey olarak yerleştirin ve PBS/HBSS'yi aspire edin. Bu yıkama ve aspirasyonu 3 kez tekrarlayın.
   5. Hücre tarafına 2 mL tripsin (rekombinant veya hayvan türevi) ekleyin (T75 şişesi yatay, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde). Standart bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO₂) 4 dakika inkübe edin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak 2 dakika sonra bir kez ezin.
   6. 4 dakikalık toplam inkübasyondan sonra, çözeltiyi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Konik tüpe 8 mL büyüme çözeltisi ekleyin (2 mL tripsinizli hücre + 8 mL ortam = toplamda 10 mL).
   7. Filtreli başka bir boş 15 mL konik tüp kullanın ve tek tek hücreler elde etmek için hücreleri 25 mL'lik bir pipet ile aktarın.
   8. Çözeltinin 1/10'unu (1 mL) (hücre + ortam + Tryp-LE) 20 mL ortam içeren bir T75 şişesine aktarın. Alternatif olarak, hücreleri sayın (adım 1.7). Tripsin olmayan bir medya çözümüne sahip olmak için ertesi gün medyayı değiştirin.
6. Ortamın ve hücrelerin dondurulması
   1. %100 FBS'yi 4 °C buzdolabında çözdürün. FBS'deki proteinlere zarar verebileceğinden su banyosu veya ısı kullanmayın.
   2. 50 mL dondurma ortamı hazırlamak için 45 mL DMEM, 5 mL FBS ve 5 mL DMSO'yu karıştırın. Aralıklı çözülmeyi ve protein hasarını önlemek için 1-2 mL'lik kaplara koyun. -20 ° veya -80 °C dondurucuda saklayın.
   3. Kalan 9 mL çözelti için (adım 1.5), toplamda 10 mL'ye ulaşmak için 1 mL ortam ekleyin. 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL donma ortamında yeniden süspanse edin (yukarıya bakın). Hücreleri -80 °C dondurucuda bir dondurma kabına koyun. Hücreleri 1 veya 2 gün sonra uzun süreli depolama için sıvı N_2'ye taşıyın.
7. Hücreleri sayma
   1. Kalan 9 mL için (adım 1.5), toplamda 10 mL'ye ulaşmak için 1 mL medya ekleyin. 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı çıkarın ve 4 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 80 μL HBSS + 10 μL% 0.4 Tripan Mavisi içinde 10 μL hücreyi yeniden süspanse edin, seyreltme faktörü = 10.
   3. Çözeltiden 17 μL alın ve bir hemositometrede dört adet 4 x 4 kare sayın. Dört 4 x 4 kare için ortalama sayımlar ve hücreler/mL elde etmek için 10⁴x seyreltme faktörü ile çarpın.

2. Ameliyat

NOT: Ameliyatın, bir kişinin hücreleri hazırlamaktan, diş çimentosunu karıştırmaktan ve genellikle prosedüre yardımcı olmaktan sorumlu olduğu, ikinci kişinin ise steril kalmaya odaklandığı iki araştırmacı tarafından yapılması önerilir. Cerrahi prosedüre yardımcı olacak ikinci bir manipülatöre sahip olmak, kontaminasyonun meydana gelme olasılığını önemli ölçüde azaltır. En iyi cerrahi uygulamaları takip etmek, ameliyat sonrası komplikasyon olasılığını azaltacaktır. Şekil 1A , kraniyal pencerenin bileşenlerine genel bir bakış sağlar.

1. Genel hazırlıklar
   1. Başlamadan önce prosedürün yerel hayvan refahı kurum yönergeleri tarafından onaylandığını onaylayın.
      NOT: Bu çalışmada 5 aylık dişi NSG fareleri (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
   2. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve gerekli tüm malzemelerin mevcut olduğundan emin olun. Anestezi ve ameliyat kayıtlarını yazdırın.
   3. Varışta, ameliyat sonrası ek sıkıntıyı azaltmak için hayvanların hayvan yetiştirme odasına en az 1 hafta alıştığından emin olun.
   4. Ameliyat günü tüm cihazların (mikroskop, ısıtma yastığı, sterilizatör, matkap, vakum vb.) kullanıma hazır olduğundan emin olunuz. Anestezi makinesinin yeterli izofluran içerdiğini onaylayın ve gerekirse yeniden doldurun. Yeni kullanıcılar için, kraniyal pencere prosedürü hayvan başına 2 saate kadar sürebilir; Bu nedenle, yeterli izoflurana sahip olmak çok önemlidir.
   5. Cam pencereleri ve baş çubuklarını alkole yerleştirin ve tuzlu su içeren bir kap hazırlayın. Bu, sterilitede herhangi bir büyük ihlal olmadan sorunsuz bir iş akışı sağlayacak ve her hayvan için anestezi altında geçen süreyi mümkün olduğunca kısa tutacaktır.
   6. Tüm cerrahi malzemeleri çalışma istasyonunda steril bir yüzeyde açın. Örneğin, steril bir gazlı bez ambalajın içi bu amaçla kullanılabilir. Yalnızca ipuçları tekniğini kullanın. Cerrahi aletler kullanılmadığında, uçları steril gazlı bez ambalajının içi gibi steril bir yüzeye yerleştirin.
   7. Birden fazla ameliyat gerçekleştirirken, tüm cerrahi aletleri dezenfekte etmek için ameliyatlar arasında sterilizatöre yerleştirin. 5'ten fazla hayvan üzerinde ameliyat yaparken, yeni bir otoklavlanmış alet seti kullanın. Doku travmasını önlemek için yenisi için körleştiğinde matkap ucunu değiştirin.
2. Anestezi ve ameliyat hazırlıkları
   NOT: Anestezi düzeni, görüntüleme için olduğu kadar ameliyat için de aynıdır.
   1. Anestezik bir odada izofluran (indüksiyon için% 3 -% 5) kullanarak fareyi uyuşturun. Pedal çekme refleksini (her iki arka ayaktaki ayak yastığı sıkıştırması) test ederek yeterli anestezi derinliğini sağladıktan sonra, hayvanı bir hazırlık çalışma istasyonuna aktarın. Anesteziyi bir burun konisi üzerinde sürdürün (%1-%2). Burada, kornea hasarını önlemek için bir göz merhemi uygulayın. Ameliyat sırasında pençe refleksini kontrol ederek refleks kaybını düzenli olarak kontrol edin.
   2. Hayvanın herhangi bir şekilde tanımlanması gerekiyorsa, kulakları işaretlemek için bir kulak delme aleti veya makas kullanın veya kuyruğu işaretlemek için bir işaretleyici kullanın.
   3. Kafatasını kulaklar ve gözler arasında kaplayan kürkü tüy dökücü bir kremle çıkarın. Cilt tahrişini önlemek için kremi üretici tarafından belirtilen süre (30-60 sn) kadar bırakın. Kremi saçın çıkış yönünün tersine sürerek saç diplerine temas ettiğinden emin olun. Tüy dökücü kremin gözlerle temas etmesinden kaçının. Bölgeyi tuzlu su ile temizleyerek krem ve saç kalıntılarını temizleyin. Alternatif olarak, makas kullanın.
   4. Ameliyat sırasında ve sonrasında herhangi bir ağrı, enfeksiyon veya şişmeyi önlemek için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler), opioidler, antienflamatuar ajanlar ve antibiyotikler uygulayın. Ameliyattan önce karprofen (5-20 mg / kg, deri altı [SQ]), buprenorfin - sürekli salım (1 mg / kg SQ), sefazolin (20 mg / kg SQ) ve deksametazon (0.2 mg / kg SQ) uygulayın. Dehidrasyonu önlemek için yaklaşık 0.3 mL% 0.9 salin SQ uygulayın.
   5. Ardından, kafatasının ortasından çevreye dairesel hareketlerle povidon-iyot ve izopropil alkolü dönüşümlü olarak üç kez temizleyerek alanı fırçalayın.
3. Kraniyotomi prosedürü
   1. Hayvanı ameliyat masasına aktarın ve işlem sırasında izotermal koşulları sağlamak için bir ısıtma yastığı (~ 37 ° C) üzerinde ventral yaslanma pozisyonuna yerleştirin. Kemirgenlerde hipotermi, hayatta kalma oranlarını önemli ölçüde azaltır ve ameliyat sonrası iyileşme aşamasını uzatır.
   2. Kulak çubuklarını ve kesici çubukları konumlandırarak kafayı stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Kulak çubukları için elmacık kemerini bulun ve çubukları kemerlerin arkasına yerleştirin. Kontralateral çubuğu baskın elinizle sabitleyerek başlayın (örneğin, sağ elinizi kullanıyorsanız sol çubuğu sağ elinizle sabitleyin) ve ardından karşı tarafı sabitleyin. Gerekirse vidaları çevirerek kulak ve kesici çubukların konumlarını ayarlayın.
   3. Gerekirse göz merhemini tekrar uygulayın ve gözleri örtmek için bir parça alüminyum folyo kullanın. Bu, daha sonra siyanoakrilat yapıştırıcıyı iyileştirmek için kullanılan parlak mikroskop ışığının ve UV ışığının neden olduğu herhangi bir hasarı önleyecektir (adım 2.5).
   4. Kesiden önce, ayak parmağı sıkıştırma refleksini tekrar kontrol edin; Gerekirse, anesteziyi buna göre ayarlayın. Sensörü arka pençeye yerleştirerek hayvanı anestezi izleme cihazına bağlayın. Kalp atış hızının ve kan oksijen konsantrasyonunun ölçülmesi, mortaliteyi azaltmaya ve ameliyat sonrası iyileşmeyi iyileştirmeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, göğüs hareketini görsel olarak inceleyerek solunum hızını elde edin.
   5. Hipotermi ve kontaminasyonu önlemek için hayvanın vücudunu bir örtü ile örtün. Ameliyata başlamadan önce son bir povidon-iyot sürüntüsü yapın.
   6. Eldiven ve temiz bir laboratuvar önlüğü giyin.
      NOT: Prosedürün invaziv olması ve 2P-IVM'de morbidite ve görüntü kalitesi kaybına neden olan herhangi bir postoperatif enfeksiyon ve inflamasyon riskini azaltmak için steril eldiven kullanılması teşvik edilmektedir (bölüm 5).
   7. Kafatası üzerindeki deriyi kaldırın ve makası sağ göz ile kulak arasında tutarak ve kesi izlerini takip ederek kafatasının sol tarafına doğru keserek bir kesi oluşturun. Ortaya çıkan yuvarlak cilt kapağını çıkarın.
      NOT: Beyindeki ilgilenilen bölgeye ve pencere boyutuna bağlı olarak kesi yeri ve çapı değişebilir. Montaj için yer sağlamak için insizyonun boyutunun başın çapından daha büyük olması gerekir (adım 2.5). Gerekirse, daha fazla alan yaratmak için insizyonu çevreleyen cilt nazikçe diseke edilebilir.
   8. Kafatası yüzeyini bir neşter bıçağı veya bir mikrokurrette ile hafifçe çizerek periosteuumu çıkarın. Kraniyal sütürlerin etrafındaki periosteuumu çıkarırken dikkatli olun, çünkü bu bölgeler kırılgandır ve kanamaya daha yatkındır. Cerrahi alanı döküntülerden temiz tutmak için salin ve vakum kullanın. Siyanoakrilat yapıştırıcısına ve diş çimentosuna daha iyi yapışmayı sağlamak için periosteuumu çizin (adım 2.5)
   9. Hücre enjeksiyonunu gerçekleştirmek için beynin bölgesini tanımlayın. Bunun için fare beyninin stereotaktik koordinatlarının bir atlasını kullanın. Beyin koordinatlarına göre, pencereyle aynı çapta bir biyopsi zımbası, cerrahi bir kalem veya otoklavlanmış bir kalem kullanarak kraniyal pencerenin konumunu işaretleyin.
   10. Matkabı baskın elinizde ve diğer herhangi bir aleti (şırınga, forseps) baskın olmayan elinizde tutun. Aynı noktada uzun süreli delme işleminden kaçının. Matkap, aşırı ısınmayı önlemek için patlamalar halinde kullanılmalıdır. Bu molalar sırasında, cerrahi görünümü temiz tutmak ve aşırı ısınmayı önlemek için kalvaryuma soğuk salin uygulayın. Kafatasının ne zaman tamamen delindiğini tespit etmek için matkap ucundan gelen duyusal geri bildirimi kullanın.
   11. Kafatası yüzeyini temizlemek için vakumla birlikte soğuk tuzlu su kullanın. Kalvaryumu açtıktan sonra gazlı bez veya pamuk uçlu aplikatör kullanmayın, çünkü pamuk ipliği kalıntıları beyin penceresini kapattıktan sonra yabancı cisim reaksiyonuna neden olabilir.
   12. Delme sırasında, yörünge ve çapın cam lamel ile aynı boyutta olduğundan emin olun. Bunu, cam lamel kafatasının üstüne yerleştirerek ve cam lamellerin kafatası penceresinin içine tam olarak oturacağını onaylayarak yapın.
   13. Kafatası flebini hafifçe bastırarak bastırmak mümkün olduğunda, parçayı cerrahi alandan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın (Şekil 1B, solda). Kafatasını bastırmak henüz mümkün değilse, kafatasının geri kalanına hala bağlı olan kafatası penceresinin alanlarında delmeye devam edin ve yeniden değerlendirin.
   14. Küçük kanama meydana gelirse, kan kaybını azaltmaya yardımcı olmak için hafif basınçla birlikte hemostatik bir sünger veya alternatif olarak buz gibi tuzlu su kullanın.
4. Hücre implantasyonu
   1. İmplante edilecek hücreleri (adım 1.7) açıklandığı gibi hazırlayın ve sayın. Hücre sayısının 200.000 hücre/μL olduğundan emin olun.
      NOT: Hücrelerin RT'de katılaşan bir zar matrisinde askıya alınması önerilir. Bu, beyin parankiminde implante edilen hücrelerin başarı oranını artıracaktır.
   2. Hücreleri buzlu bir kapta ameliyathaneye aktarın. Gaz geçirmez bir mikrolitre şırınga kullanın. Aspirasyondan önce, sıcaklık farklılıklarını önlemek için şırıngayı buz üzerinde tutun.
   3. 1 μL'yi aspire ettikten sonra, şırıngayı stereotaktik çerçevenin içine yerleştirin.
      NOT: Zamandan tasarruf etmek için X, Y ve Z eksenlerindeki konumları gösteren otomatik bir stereotaktik koordinat cihazı kullanılabilir. Lambda'ya dayalı pozisyonları manuel olarak hesaplamak da mümkündür. 1,5 μL'den fazla enjekte edilmesi önerilmez. Bu, enjekte edilen alanın aşırı dolmamasını, başarısız implantasyona, beyin parankimi dışında büyümeye veya metastazlara neden olmamasını sağlayacaktır.
   4. Beynin V2MM bölgesinde (görsel korteks 2, mediomedial kısım) implantasyon gerçekleştirin, bu da yaklaşık olarak medial ila lateral (ML): -1.2 ila -1.6 mm ve dorsaldan ventral (DV): -2.6 ila -3.5 mm koordinatlarına karşılık gelir.
      1. İki fotonlu görüntüleme için (adım 4.6), hücreleri yüzeysel beyin bölgelerine implante edin, böylece tümör kitlesi daha sonra kraniyal pencereden görselleştirilebilir. Önden arkaya (AP): 0,8 mm derinliğe 0,5 μL (100.000 hücre) enjekte edin. Beyne girerken iğneyi yavaş yavaş, kademeli olarak hareket ettirin ve enjeksiyondan sonra 30 saniye bekleyin (Şekil 1B, orta sütun).
      2. İğneyi geri çekerken ve beyin dokusundan çıkarken aynı yaklaşımı kullanın. Beyin omurilik sıvısı merkezi ve periferik sinir sistemlerinde metastazı teşvik edebileceğinden ventriküllere yakın enjekte etmekten kaçının.
5. Kraniyal pencerenin kapatılması
   1. Baş çubuğunu ve cam lamel alkolden tuzlu su çözeltisine taşıyın. Bu bileşenleri cerrahi bölgeye yönlendirmek için bir vakum ucu veya forseps kullanın.
   2. Cam lamel kafatası penceresinin içine yerleştirin ve kafatası ile cam lamel arasına az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin. UV ile aktive olan siyanoakrilat yapıştırıcı, kürlenme süresini azaltır ve kazara yer değiştirmeyi önler. Cam lamel üzerine herhangi bir yapıştırıcı dökülürse, tamamen kürlenmeden önce pamuklu uçlu bir aplikatör ile veya bir neşterin kör tarafıyla hafifçe çizerek çıkarın.
      DİKKAT: UV ışığı gözler ve cilt için zararlıdır. Yapıştırıcıyı sertleştirirken göz ve cilt temasından kaçının.
   3. Cam lamel kraniyal pencereye sabitledikten sonra baş çubuğunu uygulayın. İki bileşenli diş çimentosunu karıştırın, kafa çubuğunu konumlandırın ve çimentoyu kafatası ile kafa çubuğu arasında temas sağlayarak çevreye uygulayın. Gereksiz çimentoyu bir şırınganın ucu, neşter veya matkap ucu ile dikkatlice temizleyin.
      NOT: Diş çimentosu çok çabuk katılaşır, bu nedenle zamanında uygulanması tavsiye edilir.
   4. Kraniyal pencereyi kapattıktan sonra, diş çimentosu ile cilt arasındaki herhangi bir kafatası alanının hala açıkta olup olmadığını belirleyin. Bu durumda, cildi kapatarak kafatasını örtmek için cerrahi yapıştırıcı uygulayın. Alternatif olarak, emilebilir bir sütür materyali ile tek bir sütür gerçekleştirin.

3. Ameliyat sonrası iyileşme ve tümör büyümesi

1. Kurtarma
   1. Hayvanı, tam bilincini geri kazanana kadar bir kurtarma kafesinde ısıtılmış bir ped üzerinde izleyin. Yaralanma riskini azaltmak için ameliyattan sonra hayvanları ayrı ayrı barındırın.
   2. Elektrolitler veya şekerler içeren ticari olarak temin edilebilen su jelleri gibi bir kurtarma diyeti uygulayın. Alternatif olarak, kolay beslenmeyi sağlamak ve dehidrasyon ve hipoglisemiyi önlemek için nemlendirilmiş standart laboratuvar yemi sağlayın.
2. Izleme
   1. İyileştikten sonra, hayvanı ağrı, sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından günlük olarak izleyin. Gerekirse, analjezikler, antienflamatuar ilaçlar veya antibiyotikler uygulayın. Bir hayvan çalışma bitiş noktasına ulaşırsa, insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Son görüntüleme seansını takiben, fareyi karbondioksit boğulması ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın.
      NOT: Erken ötenazi kriterlerine örnek olarak, bunlarla sınırlı olmamak üzere, önemli kilo kaybı (% >20), nörolojik bozukluklar, nefes darlığı, ameliyat sırasında aşırı kanama veya belirgin basmakalıp davranışlar dahildir. Kafatası penceresini inceleyin ve gerektiğinde tuzlu su veya alkolle temizleyin.
   2. Tümör büyümesini izlemek ve görüntüleme zaman noktalarını planlamak için tüm vücut biyolüminesans görüntüleme (BLI) gerçekleştirin. Bunun için intraperitoneal olarak 150 mg/kg D-lusiferin enjekte edin ve 5-15 dakika sonra hayvanı görüntüleyin.

4. Nanopartikül sentezi

1. Parçacık hazırlama
   1. 50 mL 5 M NaOH, 20 mL deiyonize su (DI su) ve 20 mL epiklorohidrin içeren bir çözeltiye 11.17 mL Ferumoksitol (toplamda 6 mmol Fe) ekleyin. Bu aşamada faz ayrımını gözlemleyin. Karışımı RT'de 24 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
   2. 24 saat sonra, çözelti homojen hale gelir. 3 gün boyunca suya karşı diyaliz tüpü (12.000-14.000 Da kesme) kullanarak fazla epiklorohidrini çıkarın.
   3. Diyalizden sonra, tüpte kalan çözeltiyi bir cam şişeye aktarın (toplam hacim ~ 110 mL). 30 mL amonyak hidroksit ekleyin ve karışımı 37 °C'de 18-20 saat karıştırın.
   4. Karıştırdıktan sonra 3 gün boyunca suya karşı diyalizi tekrarlayın. Diyaliz tüpünde kalan çözeltiyi toplam hacmi ~110 mL olan yeni bir cam şişeye aktarın.
2. Floresein izotiyosiyanat (FITC) konjugasyonu
   1. FITC konjugasyonu için 27.5 mL amin ile işlevselleştirilmiş parçacıkları çıkarın. Partikülleri 10 kDa'lık bir ultrasantrifüj filtresi kullanarak konsantre edin ve 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de bir pH 9 (Na₂CO₃ / NaHCO₃) tamponu ile yıkayın.
   2. Filtreye 4 mL çözelti ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de ultrasantrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve aynı protokolle ikinci bir yıkama turu için filtreyi tamponla yeniden doldurun.
   3. Süzüntüyü atın ve çözeltiyi bir pipet kullanarak filtrede toplayın. Her parçacığın çapının 5 nm olduğunu varsayarak, parçacığın molar konsantrasyonunu Ferumoxytol'ün kütle konsantrasyonu ile tahmin edin.
   4. FITC'yi susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg / mL'de çözün. Konsantre amin ile işlevselleştirilmiş partiküle yavaşça 1.4 mL DMSO çözünmüş FITC ekleyin. FITC: parçacığının molar oranı 20:1'dir. Bundan sonra, çözeltiyi karanlıkta 8 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. Fazla_NH3 ekleyerek reaksiyonu söndürün. _H2O(_NH3'ün son konsantrasyonu. H₂O 50 mM'dir), daha sonra çözeltinin karanlıkta 2 saat boyunca 4 ° C'de kalmasına izin verin. Na₂CO₃ / NaHCO₃ (pH 9) tamponu kullanarak fazla FITC'yi 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de 10 kDa'lık bir filtreden yıkayın. Çözeltinin nihai pH'ı, HCl sulu çözeltisi kullanılarak 7.4'e ayarlanır.

5. 2P-IVM

NOT: 2P-IVM seansları için, kafatası penceresinin konumunu yatay ve dikey olarak ayarlamaya izin veren özel bir aşamaya (Şekil 2 ve Ek Kodlama Dosyası 1) sahip bir Prairie Ultima IV mikroskobu kullanıldı. Son işlem ve görüntü analizi için Fiji yazılımı kullanıldı. Bu şekilde, lazer ışını cama 90 ° açıyla çarpacak şekilde ayarlanabilir, bu da artefaktları azaltır ve görüntüleme kalitesini artırır.

1. Görüntüleme oturumu
   1. Ti-Sapphire lazeri açın. Ana sistem anahtarını ve Prairie View yazılımını açın.
   2. Hayvanı yukarıda tarif edildiği gibi uyuşturun (adım 2.2). Hayvan başına 2 saate kadar görüntüleme seansları gerçekleştirin. Anestezi komplikasyonları ve buna bağlı morbidite veya mortalite riskini azaltmak için görüntüleme süresini minimumda tutun.
   3. Özel bir aşama kullanarak fareyi iki foton mikroskobu altında hareketsiz hale getirin (Şekil 1B, sağ sütun). Hayvanı kemirgen cerrahisi için tasarlanmış ısıtılmış bir ped üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve göğüs kafesi daraltmamaya dikkat ederken bant kullanarak hafifçe sabitleyin. Kafatası penceresine bir damla su damlatın ve odağı ayarlayın.
   4. Hayvanların hayati parametrelerini izlemek için kalp atış hızı ve kan oksijenasyonu elde edin. Sensörü arka pençeye yerleştirin ve izleme cihazını iki fotonlu görüntüleme odasının dışında tutun.
   5. Hayvan mikroskop aşamasına geldiğinde, baş pozisyonunu ayarlayın. Dürbün ve geniş alan floresan aydınlatmasını kullanarak kırmızı floresan protein (RFP) filtresini ayarlayın ve istenen görüntüleme görüş alanını bulun (Şekil 1B, sağ sütun).
   6. Numune oryantasyonu ve görüş alanı belirlendikten sonra, mikroskobu geniş alan modundan ışık tarama mikroskobu moduna (LSM) geçirin.
   7. Ti-Sapphire lazerin 920 nm'de mod kilitli olduğundan ve tüm panjurların açık olduğundan emin olun. GaAsP fotoçoğaltıcı tüp dedektörleri (PMT) voltajlarını 500-600 V'a kadar getirin. 595/50 (RFP) ve 525/50'de bant geçişli filtre setlerine sahip iki PMT kullanın.
   8. Canlı Görüntü'ye basın ve bir görüntü görünene kadar örnekteki lazer gücünü artırmak için pockel hücresini yavaşça değiştirin.
   9. Net bir görüntü elde edildikten sonra, istenen örnek alanı içinde bir görüntü yığınının üstünü ve altını ayarlamak için yazılımı ve motorlu aşamayı kullanın. Adım boyutuna dikkat edin ve Z ekseninin merceğin derinliğini ayarladığını göz önünde bulundurun.
   10. Derinlik arttıkça görüntüler koyulaşacaktır. Görüntüyü parlak tutmak için pockels/PMT kazancını yavaşça artırın. Fototoksisiteye ve doku hasarına yol açabileceğinden çok fazla güç kullanmamaya dikkat edin.
   11. Bir kaydetme yolu ayarlayın ve Z serisini başlatın. Ayarlanan pockel/PMT ayarlarını kullanarak otomatik olarak başlangıç ve bitiş konumlarına geçecektir. Yığın tamamlandıktan sonra, kalite için yığına bakmak için oynatmayı kullanın. Gerekli görüntülerin alınması tamamlandıktan sonra Ti-Sapphire lazeri kapatın.
   12. Hayvanı yukarıda açıklandığı gibi bir kurtarma kafesine taşıyın (adım 3.1).
   13. Prairie görünümünden çıkın ve tüm verilerin kaydedildiğinden/aktarıldığından emin olun. Bilgisayarı kapatın ve tüm donanımı kapatın.
2. FIJI ile işlem sonrası
   NOT: Fiji, biyolojik görüntü analizine odaklanan açık kaynaklı bir yazılımdır²¹.
   1. İşletim sistemine göre FIJI'yi indirin. Klasör içeriğini açın ve .exe dosyasını çalıştırın.
   2. İki fotonlu görüntülemeden toplanan .env dosyasını iletişim kutusuna sürükleyin. Kanalları farklı görüntü kutularına bölün. Bu, biri hücre sinyalini, diğeri parçacık sinyalini içeren farklı kanallara sahip iki farklı görüntü oluşturacaktır.
   3. Resimlerden birini kopyalayın ve başka bir resim oluşturmak için Dosya > Yeni > Dahili Pano'ya tıklayın. Görüntülerden birini Kaynak , diğerini Kopyala olarak yeniden adlandırın.
   4. Kopyalanan görüntüyü kullanın ve diyalog kutusunda İşlem > Kontrastı geliştir'e tıklayın. Normalleştir ve Tamam'ı ve ardından Düzgünleştir'> İşle'yi tıklatın. Bu görüntü, analiz için değil, maske oluşturmak için kullanılır. Diyalog kutusunda Görüntü > > Eşiği Ayarla'ya tıklayın. Ayıklamak için uygun olan kayan ölçeği ve yöntemi kullanın, ardından Uygula'yı tıklayın.
   5. Arka planda tek pikselleri aşındırmak için İşlem > İkili > Aşındır'ı kullanın ve görüntüye pikselleri geri eklemek için İkili > Genişlet > İşle'yi tıklatın.
   6. İletişim kutusunda Görüntü Hesaplayıcı > İşleme'ye tıklayın, ilk olarak kaynak görüntüyü seçin ve ikinci görüntüyü Kopyala olarak seçin. Her iki görüntünün kesişimini oluşturmak için AND kullanın. Diğer kanal görüntüsü için aynı adımı tekrarlayın.
   7. Vasküler bölge dışındaki sinyal analizi için, değiştirilmemiş kopyalanmış bir görüntü açın ve Freehand ROI aracıyla sinyalin vasküler alanını silin.
   8. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya giderek istediğiniz parametreleri ayarlayın. Area, Integrated Density (Entegre Yoğunluk) ve Mean Gray Value (Ortalama Gri Değer) seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun.
   9. Şimdi Analiz > Ölçü ile analiz edin. Ölçümleri içeren bir pencere açılacaktır. Verileri bir elektronik tabloya kopyalayın.
   10. Şimdi görüntünün floresan olmayan küçük bir alanını seçin. Bu arka plan olacak.
   11. Bu bölge için Analiz > Ölç'e tıklayın. Verileri bir e-tabloya kopyalayın.
   12. Elde edilen görüntüyü Dosya > olarak kaydedin > Yeniden ölçümler veya yayınlama amacıyla dosya türünü analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada kraniyal pencere cerrahisi uyguladık ve GBM'nin NSG fare modelinde C6 hücrelerini aşıladık (n=5). Pencerenin oluşturulmasında yer alan tüm bileşenler arasında uygun bir sızdırmazlık (Şekil 1A), pencerelerin uzun süreli görüntüleme için dayanıklılığını sağlayacak ve ayrıca morbiditeyi azaltacaktır. İn vivo 2P-IVM için uyarlanmış aşamayı kullanarak (Şekil 2), anestezi altındaki hayvanları herhangi bir büyük ha...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Floresan etiketli demir oksit NP'lerin tümör iletimini değerlendirmek için bir kraniyal pencereden 2P-IVM kullanarak gerçek zamanlı in vivo NP takibi için bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür için cerrahi teknik, sabit bir el ve ileri deneysel cerrahi beceriler gerektirir. Canlı hayvan deneyimine geçmeden önce karkaslar veya hayaletler kullanarak pratik yapmanız önerilir. Alternatif olarak, Hoeferlin ve ark. termal hasarı azaltmak, cerrahi teknik değişkenliğini en aza indirmek ve cerrahiyi standa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot