Trigeminal Nöropatik Ağrıyı İncelemek İçin Farelerde Distal İnfraorbital Sinirin (DIoN-CCI) Kronik Daralma Hasarı

Özet

Farelerde distal infraorbital sinirin kronik daralma yaralanması, devam eden ağrı ve allodinin belirtileri olan dokunsal stimülasyona (von Frey saç stimülasyonuna aşırı duyarlılık) yanıt olarak spontan davranışta (artmış yüz bakım aktivitesi) ve nosifensif davranışta değişikliklere neden olur ve trigeminal nöropatik ağrı için bir model görevi görür.

Özet

Hayvan modelleri, nöropatik ağrıyı incelemek için gerekli araçlar olmaya devam etmektedir. Bu makale, farelerde trigeminal nöropatik ağrıyı incelemek için distal infraorbital sinir kronik daralma hasarı (DIoN-CCI) modelini açıklamaktadır. Bu, kronik daralma yaralanmasını gerçekleştirmek için cerrahi prosedürleri ve devam eden ağrı ve mekanik allodinin belirtileri olan spontan ve uyarılmış davranıştaki değişiklikleri değerlendirmek için ameliyat sonrası davranış testlerini içerir. Yöntemler ve davranışsal okumalar, sıçanlarda infraorbital sinir kronik daralma hasarı (IoN-CCI) modeline benzer. Bununla birlikte, IoN-CCI modelinin farelere uyarlanması için önemli değişiklikler gereklidir. İlk olarak, intraorbital yaklaşım, göz ile bıyık yastığı arasında bir kesi ile daha rostral bir yaklaşımla değiştirilir. IoN böylece orbital boşluğun dışında distal olarak bağlanır. İkincisi, farelerde daha yüksek lokomotor aktivite nedeniyle, farelerin küçük kafeslerde serbestçe hareket etmesine izin vermek, fareleri özel olarak tasarlanmış ve yapılmış kısıtlama cihazlarına yerleştirmekle değiştirilir. DIoN ligasyonundan sonra, fareler spontan davranışta ve von Frey saç stimülasyonuna yanıt olarak, IoN-CCI sıçanlarındakine benzer değişiklikler sergiler, yani artan yönlendirilmiş yüz bakımı ve IoN bölgesinin von Frey saç stimülasyonuna aşırı duyarlılık.

Giriş

Nöropatik ağrı, somatosensoriyel sinir sistemine verilen hasardan kaynaklanır ve duyusal sinyallerin beyne anormal şekilde iletilmesine yol açar. Somatosensoriyel sinir hasarı her zaman nöropatik ağrıya yol açmaz, ancak klinik nöropatinin şiddeti ile prevalans artar ^1,2. Nöropatik ağrı hastaları, spontan duyumlar (yanma, karıncalanma ve iğneler, elektrik hissi) ve anormal derecede yoğun veya uzun süreli ağrı, kronik hale gelme eğiliminde olan ve geleneksel ağrı ilaçları ile tedaviye dirençli olan zararsız veya zararlı stimülasyona kadar spesifik semptomlar yaşarlar³. Nöropatik ağrı araştırmaları alanındaki önemli ilerleme, sıçanlarda siyatik sinir etrafındaki gevşek bir şekilde daralan bağların insan nöropatik ağrı koşullarına benzeyen davranışlara yol açtığının keşfedilmesinden kaynaklanmaktadır⁴. Hayvanlar sıcağa, soğuğa ve mekanik stimülasyona karşı azaltılmış eşikler gösterir ve gürültülü davranışlar sergiler. İnsanlar ve kemirgenler arasındaki ağrı işlemedeki doğal biyolojik farklılıklara rağmen, hayvan modelleri, nöropatik ağrının gelişiminde altta yatan mekanizmaları incelemek ve yeni önerilen tedavi stratejilerini test etmek için değerli bir araçtır.

Duyusal refleks temelli ağrı testi paradigmaları nöropatik ağrı modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak devam eden ağrı veya diğer sık eşlik eden rahatsızlıkların (uyku bozukluğu, depresyon, anksiyete) ölçülmesi, bunların yaşam kalitesini etkileyen yaygın klinik semptomlar olduğu göz önüne alındığında yeterli ilgi görmemiştir 5,6,7,8 . Sıçanlarda yüz tımar davranışı, infraorbital sinirin (IoN) kronik daralma yaralanmasını (CCI) takiben spontan nöropatik ağrının bir ölçüsü olarak belgelenmiştir9,10. Ek olarak, sıçanlar ayrıca mekanik allodinin göstergesi olan IoN bölgesinin hafif dokunsal stimülasyonuna karşı aşırı duyarlılık geliştirir.

Farelerle karşılaştırıldığında, daha büyük boyutları nedeniyle, sıçanlar cerrahi yaralanmalar için daha uygundur. Bununla birlikte, fareler maliyet ve alan verimliliği sunar ve daha küçük ilaç miktarları gerektirir. Ayrıca, transgenik teknolojinin ortaya çıkışı, farelerin kullanımını daha da artırmıştır^11,12. Bu nedenle, bu prosedürün genel amacı, farelerde, sıçanlarda olduğu gibi, trigeminal nöropatik ağrının incelenmesi için spontan ve uyarılmış davranışta değişikliklere neden olan cerrahi bir infraorbital sinir yaralanması gerçekleştirmektir.

Protokol

Hayvanlar, Uluslararası ACI Araştırmaları Derneği'nin bilinçli hayvanlarda ağrı araştırması yönergelerine göre ve hayvan araştırmaları için Flaman ve Avrupa yönetmeliklerine ve ARRIVE yönergelerine uygun olarak tedavi edilir ve bakılır. Protokol kurumsal Etik Kurul tarafından onaylanır.

1. Hayvanlar

1. Erkek ve dişi C57BL/6J fareleri kullanın (Janvier, varışta 10 haftalık).
2. Erkek ve dişi fareleri, nem oranı %40-60 olan ve oda sıcaklığı (RT) 21 ± 1 °C olan bir koloni odasında standart katı tabanlı fare kafeslerinde ayrı ayrı barındırın.
3. Su ve yiyecek ad libitum sağlayın.
4. Fareleri normal bir 12:12 saat karanlık/aydınlık döngüsünde tutun (ışıklar 08:00'de yanar).

2. Ameliyat

1. Fare başına, yaklaşık 6 cm uzunluğunda bir parça kromik bağırsak ligatürü (6-0) hazırlayın ve kurumasını ve sertleşmesini ve kırılgan hale gelmesini önlemek için steril tuzlu suya koyun.
2. Fareyi ketamin / ksilazin (75/15 mg / kg, intraperitoneal, enjeksiyon hacmi 10 mL / kg) ile uyuşturun. Cildi ayak parmakları arasında sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Farenin bacağını esnetmediğinden emin olun. Gerekirse, hayvan tamamen anestezi altına alınana kadar bekleyin ve/veya ilave ketamin / ksilazin uygulayın.
   NOT: Trigeminal nöropatik ağrı gelişimine müdahale edebilecek önleyici analjezik etkilerden kaçınmak için ek analjezikler uygulanmamalıdır.
3. İnfraorbital foramenin hemen rostral olarak yaklaşık 4 mm'lik bir kesi yapmak için bıyık pedi ile göz arasındaki bukkal kılları nazikçe tıraş edin. Davranış testlerini etkileyebileceğinden bıyıklara zarar vermemeye dikkat edin.
4. Farenin kafasını stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin veya kafayı başka bir şekilde sabitleyin. Fareyi ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin veya aksi takdirde vücut ısısını korumaya dikkat edin.
5. Kurumasını önlemek için her iki göze de merhem sürün. Traşlı baş bölgesini alkolle ve ardından betadin ile ovalayın. Tıraşlı kafa bölgesini açığa çıkaran cerrahi bir örtü yerleştirin.
6. 2.7 ila 2.14 arasındaki adımlar için bir mikroskop kullanın.
7. Bıyık pedinin kenarı ile gözün yaklaşık yarısı arasında, sadece infraorbital foramen ile orta çizgiye dik ve gözün merkezi ile bıyık pedinin merkezi arasındaki çizginin etrafında ortalanmış 4 mm'lik bir cilt kesisi yapın.
8. Yüzeysel bağ dokusunu künt bir şekilde ayırarak IoN'yi açığa çıkarın. Kas hasarını en aza indirmeye ve motor sinir liflerinden kaçınmaya özen gösterin. IoN'nin gövdesinin (1-1.5 mm çapında), kafatasından çıktığı yer ile bıyık yastığına dallandığı yer arasında yaklaşık 3 mm derinlikte erişilebilir olduğundan emin olun (Şekil 1).
9. Dönme hareketi kullanarak, sinire zarar vermemeye dikkat ederek kancalı bir ligasyon yardımcısının başını IoN'nin altına kaydırın.
10. Kromik bağırsak bağını ligasyon yardımcısının ucundaki delikten yerleştirin ve ligasyon yardımcısını, bağ IoN'nin altında kalacak ve bağın her iki ucu da IoN'den aşağı yukarı eşit uzaklıkta olacak şekilde geri çekin.
11. Bağın iki ucundan bir "kayma düğümü" bağlayın ve düğümü IoN'ye doğru kaydırın. Daralma derecesinin doğru bir şekilde kontrol edilebilmesi için kayma düğümünün düzgün bir harekete izin verdiğinden emin olun. Düğümü daha fazla kaydırın ve IoN'yi daraltın. Sinirin çapını sadece gözle görülür bir miktarda azaltın⁴. Kaymasını önlemek için yarık düğümün üzerine normal bir düğüm yerleştirin.
12. Düğümün çözülmesini önlemek için bağın uçlarını yaklaşık 1,5 mm serbest uç bırakarak kesin.
13. 2.2-2.8 adımlarını izleyerek sahte ameliyatı gerçekleştirin.
14. Sentetik emilebilir dikişler (6-0) kullanarak deri kesisini kapatın ve hayvanın ısıtılmış bir ped üzerinde veya kızılötesi bir ısıtma lambası altında iyileşmesine izin verin.

3. Davranış testi

1. Ameliyat öncesi testten önce fareyi en az 8 gün boyunca muhafaza koşullarına alıştırın.
2. Ameliyat öncesi testten önce, fareyi 3 gün boyunca günde en az bir kez test prosedürüne alıştırın.
3. Normal aydınlatma koşullarında test yapın. Gerekirse, dış seslerden kaynaklanan rahatsızlıkları en aza indirmek için arka plan gürültüsü sağlayın.
4. Yüz bakım davranışının gözlemlenmesi
   1. Tek bir fareyi muhafazadan test odasına, herhangi bir yatak malzemesi olmadan kapalı bir plastik kafes içinde taşıyın. Hayvanları taşırken dış uyarılardan kaçının.
   2. Fareyi bir video kameranın önünde, yatak takımı olmayan (u x g x y: 12 cm x 12 cm x 17 cm) kapalı, şeffaf bir plastik kafese yerleştirin. Hayvanın sırtı kameraya dönükken yüzünü görmek için bir ayna yerleştirin.
   3. Farenin davranışını 10 dakika boyunca kaydedin. Kayıt sırasında, deneyi yapan kişinin odada bulunmadığından emin olun.
   4. Bir sonraki hayvanı kaydettikten sonra gözlem kafesini temizleyin.
   5. Farenin deneysel koşullarına kör olan bir gözlemcinin kaydedilen davranışı analiz etmesini sağlayın.
   6. 10 dakikalık kaydı analiz ederken her yüz bakım bölümünü not edin. Yüz bakımı, hayvanın ön ayaklarını yüz bölgeleriyle temas ettirdiği hareket kalıplarıdır.
   7. Vücut bakımı sırasında izole yüz bakımı ve yüz bakımı davranışları arasında bir ayrım yapın⁹. Bir sekanstan önce veya sonra vücut bakımı yapılmazsa, bölüm izole yüz bakımı olarak etiketlenir. Vücut bakımı, pençeleri, dili veya kesici dişleri yüz veya ön pençeler dışındaki bir vücut bölgesiyle temas ettiren hareket kalıpları olarak tanımlanır. Vücut bakımı, bir yüz bakımı sekansından önce veya sonra mevcutsa, bu bölüm, vücut bakımı sırasında yüz bakımı olarak etiketlenir.
   8. 4 sn kesme kriteri uygulayarak yüz bakım ataklarının sayısını belirleyin. Bakım eylemleri arasındaki 4 saniyeden daha kısa bir süre, tek bir bölüm içinde bir duraklama olarak tanımlanır. 4 saniyeden daha uzun bir süre, iki bölüm arasındaki tımar eylemlerinin tamamen kesilmesi olarak tanımlanır.
5. Mekanik stimülasyon testi
   1. Fareleri en fazla 6 hayvandan oluşan gruplar halinde, yatak takımlı kapalı bir kafeste muhafazadan test odasına taşıyın. Yine dışarıdan uyarılmaktan kaçınmaya özen gösterin.
   2. Fareleri birer birer masanın üzerine yerleştirin.
      1. Farenin kuyruğunu yumuşak bir silikon kelepçeye yerleştirin ve kelepçeyi manyetik olarak masanın üzerindeki metal bir plakaya takın. Silikon malzeme, kuyruk üzerindeki baskıyı en aza indirirken kuyruğun kelepçeden kaymasını önler.
      2. Hayvanın üzerine üç duvarlı bir plastik tutucu (65 mm x 25 mm x 23 mm) yerleştirin, böylece yalnızca farenin başı kaptan dışarı çıkar. Tutucunun boyutu, baş ve ön pençe hareketlerine izin verir, ancak hayvanın içinde dönmesini engeller. Son olarak, tutucuyu yerinde tutmak için tutucunun üzerine bir ağırlık koyun (Şekil 2).
   3. Dört von Frey saçından oluşan kademeli bir seri kullanın. Kılları bükmek için gereken kuvvet 0.02 g, 0.16 g, 0.4 g ve 1.0 g'dır.
   4. Fareleri sınırlayıcıya alıştırın ve 10 dakika boyunca hareketlere ulaşın. Her 30 saniyede bir, hayvan başına bir uzanma hareketi yapın.
   5. Hayvan rahat bir durumdayken, von Frey kılı bükülene kadar, vibrissae merkezine yakın IoN bölgesi içinde en hafif von Frey saçını yavaşça uygulayın. Stimülasyonun 1 saniyeden fazla sürmediğinden emin olun.
   6. Aşağıdaki yanıt kategorilerinden birine uyması için stimülasyona hayvan tepkisini puanlayın.
      1. Yanıt gelmediğinde 0 puan verin.
      2. Algılama için 1 puan verin, yani fare başını uyarıcı nesneye doğru çevirir ve ardından uyaran nesneyi keşfeder.
      3. Geri çekilme reaksiyonu için 2 puan verin, yani stimülasyon uygulandığında fare kafayı nazikçe çevirir veya hızlı bir şekilde geriye doğru çeker; Bazen, uyarılan bölgeye ipsilateral olarak tek bir yüz silme işlemi meydana gelir.
      4. Saldırmak için 3 puan verin, yani fare uyaran nesneye saldırır, ısırma ve/veya kapma hareketleri yapar.
      5. Asimetrik yüz bakımı için 4 puan verin, yani fare, uyarılmış yüz bölgesine yönelik kesintisiz bir dizi en az üç yüz yıkama darbesi sergiler.
   7. Her fare için, von Frey kıllarını artan bir yoğunluk sırasına göre uygulayın ve ipsilateral ve kontralateral tarafları rastgele uyarın. Her uyaran yoğunluğunu her iki tarafa bir kez uygulayın.
   8. Her hayvandaki dört von Frey kılına verilen yanıtlardan ortalama puanı hesaplayın. İpsilateral ve kontralateral taraflar için ayrı puanlar hesaplayın.

Sonuçlar

DIoN-CCI fareleri, izole yüz bakımı için harcanan sürede ve izole yüz bakım bölümlerinin sayısında postoperatif güçlü bir artış göstermektedir (Şekil 3). En güçlü artış ameliyat sonrası ilk hafta boyunca ortaya çıkar ve sonraki haftalarda küçülür, ancak en az 6 hafta boyunca önemli ölçüde artar. Vücut bakımı sırasında yüz bakımı az ya da çok etkilenmez.

DIoN-CCI fareleri, DioN-CCI'den son...

Tartışmalar

Sıçanlarda, vibrissotaktil ayrımcılıkta karmaşık çırpma paternlerini kontrol eden sağlam ince kas sisteminin önemi ve orta hat insizyonunun kutanöz infraorbital sinir bölgesine göreceli mesafesi göz önüne alındığında, IoN'ye intraorbital bir yaklaşımın tercih edildiği daha önce tartışılmıştır¹⁰. Diğerleri, kıllı deriye bir kesi yoluyla distal yaklaşımın, kaudalden vibrissal pede bir dizi faydası olduğunu savunmuştur

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut (6-0)	Dynek	CG602D	ligatures
Cotton applicator	Pharmacy
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Duratears	Alcon	0037-820	ophthalmic ointment
Hooked ligation aid	Fine Science Tools	18062-12
Ketalar	Pfizer		ketamine (50 mg/mL)
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Precision cotton swab	Qosina	10225
Precision trimmer	Philips	HP6392/00
Rompun	Bayer		xylazine (2%)
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011
Vicryl Rapide	Ethicon	MPVR489H	sutures