Dondurularak Saklanmış İn Vitro Kaynaklı Kan Hücrelerinden Nükleer İzolasyon

Özet

Tek çekirdekli yeni nesil dizileme analizlerini desteklemek için kriyoprezervasyonlu indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli stromal/endotel ve kan hücresi tiplerinden yüksek kaliteli çekirdeklerin çıkarılması için bir protokol açıklıyoruz. Yüksek kaliteli, sağlam çekirdekler üretmek, multiomik deneyler için zorunludur, ancak bazı laboratuvarlar için sahaya giriş için bir engel olabilir.

Özet

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı modeller, kan gelişimini anlamak için mükemmel platformlardır ve iPSC'den türetilen kan hücreleri, klinik test reaktifleri ve transfüzyon hücre terapötikleri olarak translasyonel faydaya sahiptir. Tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNAseq) ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi için Test (snATACseq) dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere multiomik analizin ortaya çıkışı ve genişlemesi, hücre gelişimi anlayışımızda devrim yaratma potansiyeli sunar. Bu, in vitro hematopoietik modeller kullanan gelişimsel biyolojiyi içerir. Bununla birlikte, bozulmamış çekirdekleri kültürlenmiş veya birincil hücrelerden izole etmek teknik olarak zor olabilir. Farklı hücre tipleri genellikle hücresel sertliğe ve içeriğe bağlı olarak özel nükleer preparatlar gerektirir. Bu teknik zorluklar veri kalitesini sınırlayabilir ve multiomik çalışmaları sürdürmek isteyen araştırmacılar için bir engel teşkil edebilir. Hücre toplama ve/veya işleme ile ilgili sınırlamalar nedeniyle numune kriyoprezervasyonu genellikle gereklidir ve donmuş numuneler, bozulmamış nükleer izolasyon için ek teknik zorluklar ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, tek çekirdekli multiomik iş akışlarında kullanılmak üzere in vitro hematopoietik gelişimin farklı aşamalarında iPSC'den türetilmiş hücrelerden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yöntem geliştirmeyi, iPSC'den türetilen yapışık stromal/endotelyal hücrelerden ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelerden çekirdeklerin izolasyonu üzerine odakladık, çünkü bunlar yapısal ve hücresel kimlik açısından çok farklı hücre tiplerini temsil eder. Açıklanan sorun giderme adımları, nükleer topaklanmayı ve döküntüleri sınırlayarak, sonraki analizler için çekirdeklerin yeterli miktar ve kalitede geri kazanılmasına izin verdi. Benzer yöntemler, çekirdekleri diğer kriyoprezervasyonlu hücre tiplerinden izole etmek için uyarlanabilir.

Giriş

Hematopoez nispeten iyi karakterize edilmiş bir gelişimsel sistemdir, ancak in vitro olarak kan hücresi oluşumunu özetleyememe, ilgili faktörlerin eksik bir şekilde anlaşıldığını gösterir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı hematopoez modelleri, temel gelişimsel faktörlerin ve ilgili biyolojinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. iPSC sistemi ayrıca kan bozukluklarını incelemek için mükemmel bir model sunar ve iPSC bazlı kan hücreleri, translasyonel ve terapötik olarak ilgili reaktifler 1,2,3,4 üretmek için geliştirilmiştir.

Protokol

1. Hücrelerin dondurularak saklanması

1. 1 mL başına >1 x 10⁶ izole iPSC türevi hücreyi 1 mL% 90 FBS ve% 10 DMSO'da dondurun. Donma hızını azaltmak ve canlı hücre geri kazanımını optimize etmek için kriyoviyalleri -80°C'de bir dondurma kabına koyun (Malzeme Tablosu). Kültür koşullarına ve hücre kimliğine bağlı olarak değişebilen önemli hücre kaybını tahmin edin.
2. 24 saat içinde -80 °C'den sıvı nitrojen deposuna geçin.

2. Hücrelerin çözülmesi

1. Sıvı nitrojen deposundan kriyovial alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 dakika çözdürün. Küçük buz kristal....

Tartışmalar

Protokol içindeki kritik adımlar
Yüksek kaliteli çekirdeklerin izole edilmesi, hızla gelişen mevcut tek çekirdek tabanlı yeni nesil dizileme modalitelerinin başarılı bir şekilde uygulanması için esastır. Bu yaklaşımlarla, özellikle de dondurularak korunmuş örneklerle ilgilenen laboratuvarlar için mevcut engelleri göz önünde bulundurarak, niyetimiz daha önce donmuş hücreler için özel olarak tasarlanmış bir nükleer izolasyon tekniği oluşturmaktı. Dondurularak saklanmı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3