Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Özet

Dendritik dikenler, çoğu uyarıcı sinapsın post-sinaptik bölmeleridir. Dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikler, nörogelişim, yaşlanma, öğrenme ve birçok nörolojik ve psikiyatrik bozukluk sırasında meydana gelir ve güvenilir dendritik omurga analizinin önemini vurgular. Bu protokol, otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga morfolojisinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini açıklar.

Özet

Sinaptik bağlantılar, nöronlar arasında bilgi alışverişine ve işlenmesine izin verir. Uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölgesi genellikle dendritik dikenler üzerinde oluşur. Dendritik dikenler, sinaptik plastisite, nörogelişim ve nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar etrafında odaklanan araştırmalarda büyük ilgi gören yapılardır. Dendritik dikenler, ömürleri boyunca toplam omurga sayısı, dendritik omurga boyutu ve farklı süreçlere yanıt olarak morfolojik olarak tanımlanmış alt tip değişikliği gibi özelliklerle yapısal değişikliklere uğrarlar. Dendritik dikenlerin bu yapısal değişikliklerini düzenleyen moleküler mekanizmaların tanımlanması morfolojik ölçüme dayanır. Bu, deneysel kanıt sağlamak için doğru ve tekrarlanabilir dendritik omurga analizini zorunlu kılar. Bu çalışma, Neurolucida 360 (otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı) kullanılarak dendritik omurga miktar tayini ve sınıflandırması için ayrıntılı bir protokolü özetlemektedir. Bu protokol, toplam omurga yoğunluğu, omurga başı hacmi ve omurga alt tiplerine sınıflandırma gibi temel dendritik omurga özelliklerinin belirlenmesine izin verir ve böylece dendritik omurga yapısal fenotiplerinin etkili bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Giriş

Dendritik dikenler, genellikle glutamaterjik sinapsların ^1,2 post-sinaptik bölgesini içeren dendritlerin çıkıntılarıdır. Dendritik dikenler, sinaptik plastisite alanında özellikle ilgi çekicidir. Sinaptik kuvvet değiştiğinde omurgalar sıklıkla değişir, uzun süreli sinaptik güçlenmede daha büyük ve daha güçlü hale gelir veya uzun süreli sinaptik depresyonda daha küçük ve daha zayıf hale gelir 3,4,5,6,7. Sinaptik plastisitenin ötesinde, dendritik dikenlerin profili yaşam boyu değişir. Erken gelişimde, bir dendritik omurga oluşumu ve büyümesi dönemi vardır, ardından kararlı bir duruma ulaşana kadar dendritik omurga budaması^{yapılır 8,9,10}. Yaşlanan beyinde omurga kaybı, beyin küçülmesine ve bilişsel gerilemeye eşlik eder¹¹. Ek olarak, birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluk anormal dendritik dikenler ile karakterizedir. Şizofreniden etkilenen bireylerde çoklu beyin bölgeleri, muhtemelen değişmiş sinaptik budamadan kaynaklanan daha az dendritik dikene sahiptir¹². Otizm spektrum bozuklukları ayrıca dendritik omurga patolojileri ile karakterizedir¹³. Dendritik omurga kaybı, hem Alzheimer hem de Parkinson hastalığının ayırt edici özelliğidir^14,15. Dendritik omurga özelliklerine ilişkin araştırmaları kapsayan çok çeşitli araştırma konuları göz önüne alındığında, doğru omurga ölçümü için teknikler büyük önem taşımaktadır.

Boyama, yani Golgi yöntemi veya boya dolgusu yoluyla nöronların etiketlenmesi veya floresan proteinlerin eksprese edilmesi, dendritik omurga görselleştirmesi için yaygın yöntemlerdir 16,17,18. Görselleştirildikten sonra, dikenler çeşitli ücretsiz ve ticari olarak temin edilebilen yazılım istemcileri ile analiz edilebilir. Analizin istenen çıktısı, hangi yazılımın en çok kullanılacağını belirlemede önemli bir faktördür. Fiji, dendritik omurga yoğunluğuna odaklanan sorular için uygun bir yazılım seçeneğidir. Bununla birlikte, bu teknik büyük ölçüde, önyargı potansiyelini ortaya çıkarabilecek zaman alıcı manuel saymaya dayanır. SpineJ gibi yeni eklentiler, otomatik nicelemeye izin vererek ayrıca daha doğru omurga boynu analizine olanak tanır¹⁹. Bu yaklaşımların bir dezavantajı, SpineJ iki boyutlu görüntü yığınlarıyla sınırlı olduğundan, omurga hacmini belirlemek için üç boyutlu bir analizin kaybıdır. Ek olarak, omurga alt tipi bilgisinin elde edilmesi bu süreçlerle zorlaşır. Dört baskın omurga alt tipi, ince, mantar, güdük ve filopodia, hepsi bireysel işlevleri çağrıştırır ve büyük ölçüde morfoloji²⁰ ile sınıflandırılır. İnce dikenler, uzun bir boyun ve tanımlanmış bir kafa ile karakterizedir²¹. Mantar dikenleri çok daha büyük ve belirgin bir omurga kafasına^{sahiptir 22}. Güdük omurgalar kısadır ve baş ile boyun arasında çok az fark vardır²³. Filopodia, uzun, ince boyunlu ve açıkça gözlemlenebilir bir başı olmayan olgunlaşmamış dikenlerdir²⁴. Sınıflandırma değerli bilgiler sağlarken, dikenler bir boyut sürekliliği üzerinde bulunur. Kategorilere ayırma, morfolojik ölçüm aralıklarına^{dayanmaktadır 25,26}. Sınıflandırma için omurgaların manuel olarak ölçülmesi, bu yaklaşımdaki araştırmacılar için lojistik yükü artırır.

Özellikle üç boyutlu dendritik omurga analizine odaklanan diğer yazılım seçenekleri, omurga hacmi ve alt tip özellikleri 27,28,29,30,31 ile ilgili araştırmalar için daha uygundur. Zayıf z-düzlemi çözünürlüğü ve smear gibi üç boyutlu analizin sunduğu zorluğa rağmen, bu yazılım seçenekleri, dendritlerin ve dendritik dikenlerin kullanıcı güdümlü yarı otomatik bir şekilde güvenilir üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına izin verir. Tanımlanan omurgaların alt tiplerine göre otomatik olarak sınıflandırılması da bu omurga analizi yazılım paketlerinin bazılarında bulunan bir özelliktir. Bu, potansiyel iş yükü ve deneysel önyargı endişelerini iyileştirebilir. Neurolucida 360, güvenilir ve tekrarlanabilir üç boyutlu dendritik omurga tanımlaması ve sınıflandırmasına olanak tanıyan, ticari olarak temin edilebilen bir yazılımdır³². Burada, bu yazılımı kullanarak sabit dokuyu etkili bir şekilde hazırlamak, görüntüler elde etmek ve nihayetinde dendritik dikenleri ölçmek ve sınıflandırmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırmalarında Hayvanları Kullanma Yönergelerini takip etti ve Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Sabit hipokampal dilimlerin hazırlanması

1. Fareleri intraperitoneal Ketamin / Xylazine enjeksiyonu ile uyuşturun (Ketamin: 100 mg / kg; Ksilazin: 8 mg / kg). Anesteziyi kuyruk tutamıyla doğrulayın ve fareyi perfüzyon plakasına yapıştırın.
2. Büyük cerrahi makas kullanarak, göğüsteki deriyi ve kürkü çıkarın, bu da alttaki göğüs kafesinin daha kolay görüntülenmesini sağlar.
3. Karaciğer ve diyaframdan kaçınarak göğüs kafesinin genişliğinin altında yatay bir kesim yapın. İnce forseps kullanarak, ksifoid sürecini yukarı çekin ve göğüs kafesinin her iki yan tarafını kesin. Göğüs kafesini boyun bölgesine doğru çevirin ve hemostat forseps kullanarak yerine kenetleyin.
4. Kalbin sol ventrikülüne 21 G'lik bir kelebek iğne yerleştirin ve yaklaşık 5 mL / dk'da 1x PBS oda sıcaklığında perfüze etmeye başlayın. Küçük bir cerrahi makasla sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın. Atriyumdan çıkan çözelti berraklaşana kadar PBS ile perfüzasyon yapın.
5. Tüpe kabarcık girmediğinden emin olmak için perfüzyon pompasını kapatın. Boruyu PBS'den PBS'deki buz gibi soğuk %4 paraformaldehite (PFA) yerleştirin. Hayvan tamamen sertleşene kadar, yaklaşık 25 mL PFA ile 5 mL / dk oranında perfüz.
   NOT: Optimum sabitleme için PFA'nın taze olduğundan emin olun (stok 1°C'de saklanırsa 4 haftadan eski olmamalıdır).
6. Cildi kafatasının yüzeyinden küçük bir cerrahi makasla çıkarın. Kafatasının merkezi çatlağı boyunca küçük cerrahi makasla orta sagital bir kesim yapın. Koku soğancığına ve beyincik üzerinde rostral yanal kesimler yapın.
7. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını ince forseps ile açın. Bir spatula kullanarak beyni koku alma ampullerinden nazikçe çıkarın ve gece boyunca PBS'de %4 PFA'ya yerleştirin.
   NOT: Daha kapsamlı bir kemirgen perfüzyonu protokolü için lütfen Gage ve ^ark.33'e bakın.
8. 1 gün boyunca PBS'deki %4 PFA'yı %15 sükroz ile değiştirerek sabit beyni kriyoprotekte edin. Bunu takiben,% 15 sakarozu% 30 sükroz ile PBS çözeltisinde 1 gün boyunca beyin çözelti içinde batana kadar değiştirin.
9. Beyni sükroz çözeltisinden çıkarın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir neşter bıçağı kullanarak beyincik ve koku soğancığını kesin.
10. Numune tutucu yüzeyine 1-2 cm çapında küçük bir miktar optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) yerleştirin. Beyni, OCT'deki kaudal kesim yüzeyi ile numune tutucuya koronal olarak monte edin. Numune tutucuyu gözle görülür şekilde donana kadar, yaklaşık 5-7 dakika toz haline getirilmiş kuru buza yerleştirerek beyni hızlı bir şekilde dondurun.
11. Düzgün kesitler oluşturmak için kriyostatın bıçak açısının 0° ile 5° arasında ayarlandığından emin olun. Optimum dilim düzleştirme için rulo plaka açısını ayarlayın. Özel talimatlar için lütfen ekipman kılavuzuna bakın.
12. Örnek tutucuyu, beynin ventral yüzeyi bıçağa en yakın olacak şekilde kriyostata yerleştirin. Beyni 30 μm dorsal hipokampal bölümlere ayırın ve tüm dilimleri rostral hipokampusa atın.
    NOT: Protokolün bu kısmı, istenen herhangi bir beyin bölgesine uyarlanabilir. Adım 1.9-1.12, ilgilenilen bölgeye bağlı olarak değişecektir.
13. Dorsal hipokampal dilimleri PBS'ye aktarın. Bir boya fırçası kullanarak, hipokampal bölümleri bir mikroskop lamına nazikçe monte edin. Fazla solüsyonu pamuklu çubuklarla veya hassas görev mendilleriyle çıkarın.
14. Tüm beyin dilimlerini kaplayan mikroskop lamına 100 μL sert ayarlı montaj ortamı uygulayın. Kabarcıkları önlemek için, lameli forseps kullanarak montaj ortamına yavaşça indirin. Kabarcıklar oluşursa, kaçmalarına izin vermek için lamellere forseps ile hafifçe vurun. Görüntülemeden önce slaytların gece boyunca ayarlanmasına izin verin.

2. Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme

1. Floresan hücreleri tanımlamak için düşük büyütmeli göz mercekleri kullanın. 63x (NA = 1.4) veya daha yüksek bir hedefe geçin ve hedefe uygun daldırma ortamı uygulayın.
   NOT: En iyi sonuçlar için, 63x veya daha yüksek objektife sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın.
2. Görüntü elde etmek için sınırlı örtüşme ile iyi etiketlenmiş dendritik segmentleri tanımlayın. Floresan dendritlerin doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. Ek olarak, tarama hızını azaltmak daha iyi görüntü çözünürlüğü sağlayabilir.
3. Gelecekteki analizler için tüm dendritik segmentleri kapsayan z-yığınları edinin. 10 μm'den daha büyük Z-yığınları, z-düzleminde dendritik örtüşme potansiyeli nedeniyle istenmeyen bir durumdur.
   NOT: Mevcut en küçük z adımlı boyutu (0.2-0.7 μm) ve 1 havadar birim iğne deliği boyutunu kullanın. Daha küçük adım boyutu, z-yığınında daha fazla görüntü ile sonuçlanır ve birçok mikroskobun sınırlı Z çözünürlüğünü telafi eder.
4. İsteğe bağlı: Varsa, görüntüleri dekonvole etmek için mikroskobun ilgili evrişim çözme yazılımı işlevselliğini kullanın. Bu, daha yüksek çözünürlüklü görüntülere izin verecektir.

3. Dendritik omurga ölçümü

1. Neurolucida 360'ı açın (v2022.1.1 veya üstü). Görüntü dosyasını omurga analiz yazılımında açın (Dosya > Görüntüyü > Aç). Görüntü dosyasının ana pencerede ve 3B Ortamda görünür olduğundan emin olun. 3B ortam penceresi görünmezse, İzleme sekmesindeki ana pencerenin üst araç çubuğundaki 3B Ortam'a sol tıklayın (Ek Şekil 1)
   NOT: Protokolün bu bölümü, yalnızca fare dokusundan elde edilen dendritler için değil, herhangi bir dendritik görüntü için uyarlanabilir.
2. 3B Ortam penceresinin Görüntü Görüntüsünü Değiştir sekmesindeyken, görüntünün Görüntüyü Farklı Görüntüle kutusunda 3B Ses Düzeyi olarak görüntülendiğinden emin olun. Görüntü sekmesinin Görüntü Yığını Ayarları kutusunda, Yüzeyi Farklı Göster açılır menüsünde Maksimum Projeksiyon'u seçin. (Ek Şekil 2)
3. İzleme için uygun bir dendritik segment belirleyin.
   1. 3B Ortam penceresinin üst araç çubuğundaki Pivot Noktasını Taşı aracını sol tıklatın. Yeni bir pivot noktası ayarlamak için istediğiniz dendrite sol tıklayın. Bu, etkili yakınlaştırmayı etkinleştirmek için yönü değiştirecektir.
   2. Reset Orientation (Yönlendirmeyi Sıfırla) simgesine sol tıklayarak orijinal yönlendirmeyi yeniden oluşturun. Pivot noktasını ayarladıktan sonra, dendriti izlemeye başlamak için Pivot Noktasını Taşı aracına sol tıklayın. (Ek Şekil 2).
      NOT: İdeal dendrit, koordinat düzlemlerinin herhangi birinde diğer dendritlerle sınırlı örtüşme olan ve başka bir dendrit ile kesişmeyen veya altındaki bir başkasıyla yüzeysel olmayan dendrittir. Komşu dikenlerin izlenen dendrite uygun olmayan şekilde atanmasını önlemek için XY düzlemindeki diğerlerine düşük yakınlıktaki dendritler de tercih edilir. Somadan farklı kalınlık, düzen ve mesafelerdeki dendritlerin farklı dendritik omurga yoğunluklarına sahip olduğuna da dikkat edilmelidir^34,35. Bunun deneysel tasarımda hesaba katılması gerekir. İkincil dereceden dendritler <1.5 μm kalınlıkta izleme için ideal adaylardır (Şekil 1).
4. 3D Ortam penceresinin Ağaç sekmesine sol tıklayın. İzleme modu için User-Guides'ı ve User-Guided Tracing Options'daki yöntem olarak Directional Kernels'i sol tıklayın.
5. İzlemeye başlamak için dairesel bir çekirdek göründüğünde dendrite sol tıklayın. İmleci dendritik segment boyunca hareket ettirin. Bu, çekirdekleri otomatik olarak dolduracaktır. Çekirdekler otomatik olarak doldurulmuyorsa, adım 3.51'e bakın.
   1. Çekirdekler dolana kadar imleci dendrit üzerinde yavaşça ileri geri hareket ettirin. Mevcut algılanan çekirdekleri korumak için sol tıklayın. Çekirdeklerin doldurulması durursa, bir çekirdek dendritin daha aşağısına dolduğunda manuel olarak yerleştirmek için sol tıklayın. İzlemeyi sonlandırmak için sağ tıklayın. İzlenen dendritin en az 7 μm uzunluğunda olduğundan emin olun (Ek Şekil 3).
6. 3B Ortamın üç yönünü de (eğim, sapma ve yuvarlanma) kullanarak, 3B Ortam penceresini sol tıklatıp sürükleyerek dendritik izlemenin doğruluğunu doğrulayın. Dendritik izlemenin dendrit üzerindeki uygun konumun dışında olduğu noktaları belirleyin. Yukarıdan aşağıya doğru bir şekilde izlendiği durumlar olabilir, ancak z boyutunda noktalar dendrit üzerinde değildir (Şekil 2).
7. Düzgün izlenmeyen dendritik segmentleri düzeltmek için, Ağaç menüsündeki Düzenle sekmesine sol tıklayın. İlgilendiğiniz dendriti sol tıklayın, ardından Noktalar'ı sol tıklayın.
8. Yanlış yerleştirilmiş noktaları tıklama ve sürükleme yoluyla dendrit segmentine geri taşıyın. Noktayı sol tıklatıp Sil düğmesini tıklatarak yabancı noktaları silin. Dendrit yeterince doldurulmamışsa noktaların boyutunu değiştirin. Noktanın boyutunu değiştirmek için, bir noktaya sol tıklayın ve boyutu değiştirmek için kalınlık kaydırıcısını ayarlayın (Ek Şekil 4).
   NOT: Yetersiz doldurulmuş dendritler, dendritik segmentin bileşenleri olan yanlış dikenlerin tanımlanmasına neden olabilir. Tersine, dendritlerin aşırı doldurulması gerçek dikenleri gizleyebilir.
9. Adım 3.10'da omurga tanımlamasına geçmeden önce görüntüdeki birden fazla dendrit için 3.3-3.8 adımlarını tekrarlayın.
10. 3D Ortam penceresindeki Omurga sekmesine sol tıklayın. Dış aralık, minimum yükseklik ve minimum voksel sayısı için algılama ayarlarını yapın. Hazırlığa bağlı olarak, değişiklikler için açık ve spesifik bir gerekçe olması durumunda önceden ayarlanmış değerlerin değiştirilmesi gerekebilir. Önceden ayarlanmış koşullar Dış Aralık: 2,5 μm, Minimum Yükseklik: 0,3 μm, Minimum Voksel Sayısı: 10 Voksel'dir.
    NOT: Hücre kültürleri ve akut dokular gibi farklı preparatlar ve farklı gelişimsel zaman noktaları, mevcut literatürden türetilmesi gereken farklı kriterler gerektirecektir. Algılama ayarlarının değiştirilmesinin sonuçları önemli ölçüde değiştirebileceğini unutmamak da çok önemlidir. Örneğin, daha yüksek bir minimum yükseklik kısa dikenleri hariç tutabilir. Algılama ayarları, deneyin tüm seyri boyunca tutarlı kalmalıdır.
11. Dedektör Hassasiyetini %70'e ayarlayın ve Tümünü Algıla'ya sol tıklayın. Bu, tüm dendritler üzerindeki bu dedektör hassasiyeti tarafından tanımlanan dikenleri dolduracaktır. Dikenlerin dendrite özgü bir şekilde seçilmesi isteniyorsa, En Yakın Daldaki Tümünü Algılamak için Görüntüye Tıklayın kutusuna sol tıklayın ve farklı dedektör hassasiyetlerine sahip her bir dendrite manuel olarak sol tıklayın.
    NOT: Bu aşamada, dendritik dikenlerin tümünün çoğalmaması normaldir. Benzer şekilde, diken olmayanlar uygunsuz şekilde doldurulabilir. Başlangıçtaki %70 hassasiyet de esnektir; Bu, hazırlığa bağlı olarak değişebilir.
12. Dendriti her üç yönde de tıklayıp sürükleyerek bu dedektör hassasiyeti tarafından seçilen dikenleri inceleyin. Tespit edilen dikenlerin çoğu tam olarak doldurulmamışsa, adım 3.12.1'e geçin. Tespit edilen dikenler aşırı doldurulmuşsa, adım 3.12.2'ye geçin. Tespit edilen dikenler yeterince doldurulmuş gibi görünüyorsa, adım 3.13'e geçin.
    1. Dedektör Hassasiyetini %5-%10 oranında artırın ve Tümünü Algıla'ya tekrar sol tıklayın. Bu, daha önce tespit edilen tüm dikenleri daha yüksek hassasiyette yenileriyle değiştirecektir. Tespit edilen dikenler yeterince dolana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
    2. Dedektör Hassasiyetini %5-%10 oranında azaltın ve Tümünü Algıla'ya tekrar sol tıklayın. Bu, daha önce tespit edilen tüm dikenleri daha düşük hassasiyette yenileriyle değiştirecektir. Tespit edilen dikenler yeterince dolana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
13. 3B Ortamın Omurga sekmesinde Mevcut Omurgaları Koru'ya sol tıklayın. En Yakın Şubede Tümünü Algılamak için Görüntüye Tıklayın seçiliyse, seçimini kaldırın.
    NOT: Mevcut Dikenleri Koru seçeneğini işaretleyerek, yeni tanımlanan dendritik dikenlerin manuel olarak daha önce tanımlanmış dikenlerin üzerine yazmamasını sağlar. Önceki çalışmanın üzerine yazmamak için devam etmeden önce bu kutunun seçili olduğundan emin olun.
14. Pivot Noktasını Taşı'ya sol tıklayın ve pivot noktasını ayarlamak için daha fazla omurga algılaması gerektiren dendrite sol tıklayın.
    1. Pivot Noktasını Taşı seçimini kaldırın. Doldurulmamış bir dendritik omurgayı tanımlayın. Dedektör Hassasiyetini önceki algılamanın %10-20 ötesine çıkarın ve omurgaya sol tıklayın. Tespit edilen omurga yetersiz veya aşırı doluysa, adım 3.14.3 veya 3.14.4'e geçin. Omurga tam olarak yerleşmezse, Seçilen konumda bir omurga tespit edilemiyor mesajı görünecektir. Bu durumda, adım 3.14.2'ye geçin.
    2. Omurga tespit edilene ve yeterince doldurulana kadar Dedektör Hassasiyetini kademeli olarak, muhtemelen %100'ün üzerine çıkarın. Omurga tespit edilmiş ancak yetersiz doldurulmuşsa, adım 3.14.3'e geçin. Omurga aşırı doldurulmuşsa, adım 3.14.4'e geçin (Şekil 3).
    3. Düzenle sekmesine sol tıklayın ve az doldurulmuş sırta sol tıklayın. Kaldır'a sol tıklayın. Düzenle sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5-10 oranında artırın ve omurgaya sol tıklayın. Omurga hala yetersiz doldurulmuşsa bu adımı tekrarlayın.
    4. Düzenle sekmesine sol tıklayın ve aşırı doldurulmuş sırta sol tıklayın. Kaldır'a sol tıklayın. Düzenle sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5-10 oranında azaltın ve omurgaya tıklayın. Omurga hala aşırı doluysa bu adımı tekrarlayın.
15. Görsel tanımlama ile tanımlanan tüm dikenler tespit edilene kadar 3.14-3.14.4 adımlarını tekrarlayın. Komşu dendritlere ait herhangi bir diken, gerçek sinyale karşılık gelen yanlış dikenler veya omurga olarak yanlış etiketlenmiş potansiyel dendrit segmentleri için dendriti iki kez kontrol edin. Remove (Kaldır ) işleviyle bu sahte dikenleri silin.
16. Dendrit üzerinde tanımlanan dikenleri inceleyin. Bazı durumlarda, birden fazla diken tek bir konglomera omurga olarak görünebilir. Bir omurga iki kişiyi kapsıyor gibi görünüyorsa, Düzenle sekmesine sol tıklayın. Sırtı sol tıklatın ve Seçimi Gizle'yi sol tıklatın. Bir konglomera omurgasını onayladıktan sonra, Düzenle sekmesinde Seçimi Göster'e sol tıklayın ve Böl'ü seçin. Bir konglomerada ikiden fazla diken varsa, bu adımın tekrarlanması gerekebilir (Şekil 4).
    NOT: Konglomera omurgası adım 3.16'dan sonra ayrılmazsa, omurgayı çıkarın. Ardından, daha düşük bir hassasiyette konglomeranın daha yoğun omurgasını seçin. Daha yoğun omurga dolduğunda, diğer doldurulmamış omurgayı seçmek için hassasiyeti artırın. Alternatif olarak, konglomera omurgasını silmek ve ardından hassasiyeti artırmak, uygun bölünmeye izin verebilir.
17. Görsel olarak tanımlanabilir tüm dikenler algılanıp uygun şekilde doldurulduktan sonra, Omurga sekmesinde, dikenleri dört alt türe ayırmak için Tümünü Sınıflandır'a sol tıklayın: ince, mantar, güdük ve filopodia (Şekil 5).
    NOT: Omurga sınıflandırma parametreleri, Omurga sekmesindeki Sınıflandırma kutusunun Ayarlar penceresinden değiştirilebilir. Dedektör ayarlarında olduğu gibi, mevcut parametreleri değiştirmek için net bir gerekçe şiddetle tavsiye edilir. Önceden ayarlanmış değerler baş-boyun oranı: 1.1, uzunluk-kafa oranı: 2.5, mantar kafası boyutu: 0.35 μm, Filopodium Uzunluğu - 3 μm'dir.
18. 3D Environment (3B Ortam) penceresinin üst araç çubuğunda, Save and View in Neurolucida Explorer'ı seçin. Neurolucida Explorer, verilerin izlemelerden toplandığı yerdir. Çalışma, tüm izleri ve dikenleri içeren bir .dat dosyası olarak kaydedilecektir.
19. Görünüm sekmesindeki Explorer penceresinde, tüm dendritleri ve dikenleri vurgulamak için Tümünü Seç'e sol tıklayın.
20. Üst araç çubuğundaki Analiz sekmesine sol tıklayın. Yapı açılır menüsünü sol tıklayın. Sol tıklama Dallı Yapı Analizi.
21. İlgilenilen değişkenlere bağlı olarak, analizlerden herhangi biri seçilebilir. Omurga yoğunluğu ve ortalama omurga hacmi etrafında odaklanan sorular için en yararlı ikisi, Her Dendrit > Her Ağaç ve Omurga Detayları > Dikenler'dir. Tamam'ı seçtiğinizde veriler iki ayrı pencerede görünür.
22. Daha fazla derleme ve analiz için verileri bir elektronik tabloya kopyalayın.
    NOT: Tek tek ağaç dendrit ile ayrılacak, ancak omurga hacmi olmayacaktır. Elektronik tablodaki sıralama işlevi kullanılarak, omurga ayrıntıları özelliklere göre filtrelenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu analiz yönteminin etkin bir şekilde kullanılması, izleme için dendritik segmentlerin seçimi ile başlar. Şekil 1'de açıklandığı gibi, izleme için ideal dendritler diğer dendritlere yakın değildir. Paralel olarak çalışan dendritler, komşu bir dendritten dikenlerin yanlış tanımlanmasına neden olabilir. Farklı bir z-düzleminde doğrudan kesişen veya dik olarak çalışan dendritler, doğru dendritik izlemeye de önemli zorluklar ka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, numune hazırlama, görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga miktar tayini ve sınıflandırma sürecinin belirli adımlarını detaylandırır. Bu yazılım, çok çeşitli araştırmalara katkıda bulunan sağlam yapısal veriler üretebilen güçlü bir araçtır. Süreç boyunca, bu protokolü daha az metodolojik bir yük haline getiren ve verilerin genel çıktısını artıran bazı kritik adımlar vardır. Dendritik dik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10