Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Özet

Burada, taze melanom dokularından ayrışmış hücre süspansiyonlarını kültürleyerek melanom hastadan türetilmiş organoidler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, hastaya özgü tümörleri in vitro olarak aslına uygun olarak özetleyerek, tümör immünosupresif mekanizmalarını, ilaç taramasını, ilaç direnç mekanizmalarını ve kanser sürveyans yaklaşımlarını keşfetmek için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Özet

İmmünoterapinin gelişmesiyle birlikte, doğal tümörlerin tümör mikroçevresini özetleyebilecek modellerin geliştirilmesine devam eden bir ihtiyaç vardır. Geleneksel iki ve üç boyutlu modeller, kanser gelişimi ve ilerlemesi hakkında fikir verebilirken, bunlar, doğal tümörlerin sadık bir taklidini engelleyen önemli yönlerden yoksundur. Çok dikkat çeken alternatif bir model, hastadan türetilen organoiddir. Bu organoidlerin gelişimi, karmaşık hücreler arası iletişimi, tümör mikroçevresini ve tümörlerin histomimarisini özetler. Bu makale, melanom hastadan türetilmiş organoid (MPDO) modellerin oluşturulmasına yönelik protokolü açıklamaktadır. Bu modelleri doğrulamak için, organoidlerin hücresel heterojenliğini doğrulamak için T hücresi aktivasyon belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri de dahil olmak üzere bağışıklık hücresi bileşimini değerlendirdik. Ek olarak, MPDO'ların hücresel tedavilerdeki potansiyel faydasını tanımlamak için, organoidlerin γδ T hücreleri ile tedavi edilmesinin sitotoksik yeteneklerini değerlendirdik. Sonuç olarak, MPDO modelleri, tümör karmaşıklığını anlamak, terapötik stratejileri doğrulamak ve potansiyel olarak kişiselleştirilmiş tedaviyi ilerletmek için umut verici yollar sunmaktadır.

Giriş

Konvansiyonel 2 boyutlu hücre kültürü modelleri, kanserin ilerlemesini ve tedavisini incelemek için kanser araştırmalarında temel araçlardır¹. Bu modeller, kanser gelişimi ve ilerlemesinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için kontrollü deneysel koşullara izin vermekle kalmaz, aynı zamanda uygun maliyetli ve nispeten hızlı deneysel sonuçlar sağlar. Bununla birlikte, mono-kültür modellerinin eş düzlemli bir doğasında özetlenemeyen tümör mikroçevresindeki (TME) sınırlı hücresel çeşitlilik nedeniyle kullanımları sınırlıdır². Ek olarak, hücre kültürü modelleri insan vücuduna kıyasla aşırı basitleştirilmiş bir ortam sunar³. Bu nedenle, kanserin ilerlemesini daha iyi anlamak ve etkili tedaviler geliştirmek için araştırmacılar, TME'yi doğada yakından özetlemeyi amaçlayan yenilikçi modellere yönelmişlerdir. Sonuç olarak, bu modellerde doğal tümörlere sadakati korumak çok önemlidir. Kanserin karmaşık doğası göz önüne alındığında, orijinal tümörden herhangi bir önemli sapma, tümör davranışı hakkında anlamlı sonuçları karıştırabilecek öngörülemeyen değişkenlere neden olabilir.

Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), tümör ilerlemesinin in vivo olarak izlenmesine izin veren bir model sistem olarak ortaya çıkmış olsa da, bazı sınırlamalar, geliştirilen tümörün insan kanser biyolojisini ne kadar iyi özetlediğini sorgulamaktadır⁴. Örneğin, melanom TME, tümöre sızan bağışıklık hücreleri ve stromal hücreler içerir. Bir ksenogreft olarak geçtiğinde, hastadan alınan kanser olmayan hücreler yavaş yavaş kaybolacak ve bu da hasta tümörlerindekinden farklı adaptasyonları seçebilecektir. Bu sınırlamalar, PDX'in in vivo olarak sınırlı geçişleri gerçekleştirilerek hafifletilebilirken, türler arasındaki farklılıklar, PDX'te doğal tümörünkinden sapan genetik değişiklikler riski oluşturabilir⁵. Ayrıca, PDX modelleri tipik olarak insan dokularının reddedilmesini önlemek için bağışıklığı baskılanmış farelerde kurulur. Bu, özellikle immünoterapötik çalışmalarda, konakçı bağışıklık sisteminin kanserdeki rolünü inceleme yeteneğini sınırlar⁶. Biz ve diğerleri, PDX'leri "insanlaştırılmış" farelerde^{aşıladık 7,8}. Bununla birlikte, insanlaştırılmış farelerde PDX modelleri oluşturmak zaman alıcı ve pahalıdır. Bir hastanın tümör örneğinden tek bir PDX modeli geliştirmek birkaç aydan yıla kadar sürebilir, bu nedenle araştırmanın hızını ve ölçeğini sınırlar. Bu sınırlamalara rağmen, PDX modellerinin TME'nin biyolojisini doğru bir şekilde temsil ettiği gösterilmiştir, bu nedenle diğerlerinin yanı sıra kanser terapötikleri, kişiselleştirilmiş tıp ve immünoterapinin geliştirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır⁹.

Ortaya çıkan alternatif bir 3D kültür tekniği, fenotipik heterojenliği, histomimariyi ve hücreler arası iletişimi koruyan modeller oluşturmak için yeni rezeke edilmiş bir hasta tümörünün kültürlendiği hasta kaynaklı organoiddir (PDO)¹⁰. Doğal tümörlere çok benzeme yeteneği, kas invaziv olmayan (NMIBC) ve kas invaziv mesane kanserinden (MIBC) kültürlenmiş organoidlerin ebeveyn tümörlerinin temel yönlerini başarılı bir şekilde özetlediği daha önce gösterilmiştir¹¹. Diğer modellere göre potansiyelleri ve avantajları nedeniyle, PDO'lar, hücresel ve hedefe yönelik tedavilerin yanı sıra bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerinin incelenmesi ve geliştirilmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, diğer modellerde bulunmayan çok çeşitli özel uygulamalar sunar. Örneğin, daha önce tümör infiltre eden lenfositlerin (TIL'ler) IL-2 ve anti-PD1 antikorları (αPD-1) tarafından genişletilme yeteneğini incelemek için melanom hastadan türetilmiş organoidleri (MPDO'lar) kullandık. Sonuçlar, IL-2 ve αPD-1 tarafından genişletilen TIL'lerin sadece daha yüksek bir sayıya sahip olmadığını, aynı zamanda MPDO'lara başarılı bir şekilde sızabildiğini ve diğer yöntemler kullanılarak genişletilen TIL'lerden daha yüksek verimlilikle melanom hücrelerini öldürebildiğini gösterdi¹². Anti-PD-1 ve/veya anti-PD-L1 kullanımının PDO'larda TIL'lerin işlevsel kalmasına yol açtığı ve bunun sonucunda tümörün ölmesine yol açtığı diğer gruplar da benzer sonuçlar göstermiştir¹³. Ek olarak, grubumuz γδ T hücresi infiltrasyonunu ve öldürme yeteneğini değerlendirmek için MPDO'ları da kullanmıştır¹⁴. PDO'ların uygulanabilirliği, TIL genişlemesi, sitotoksisite çalışmaları ve küçük molekül taraması dahil olmak üzere çok çeşitli alanları kapsar. Tüm bu uygulamalar, bu modelin sağladığı potansiyeli ve kullanılabilirliği vurgulamaktadır. Bu nedenle, MPDO'ların kültürü için ayrıntılı protokolü açıklıyoruz.

Protokol

İnsan melanom dokuları, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan doku toplama protokolü (UPCC08607) kullanılarak Pennsylvania Üniversitesi'nde tedavi gören hastalardan elde edildi. Tüm hastalar bilgilendirilmiş onam imzalamıştır. İnsan melanom dokularının rezeksiyonunu takiben, tümör dokusu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) yerleştirilir ve işlenene kadar (6 saat içinde) 4 ° C'de tutulur. Melanom hasta kaynaklı organoidler (MPDO'lar), Şekil 1'de gösterildiği gibi taze bir tümörden türetilmiştir.

1. İnsan melanom dokusundan hücrelerin izolasyonu

1. Prosedür başlamadan önce hazırlıklar
   NOT: Ayrışmış melanom dokusunu kültürlemek için iki kültür yöntemi (Matrigel ve kollajen jel) kullanılabilir:
   1. Matrigel yöntemi için: GFR Bazal Membran Matrisini organoid kültür ortamı ile seyrelterek Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisinin bir kaplama çözeltisini hazırlayın (bkz. Tablo 1) 1: 2 oranında. 48 oyuklu bir plakanın birkaç oyuğunun her birine yaklaşık 115 μL çözülmüş çözelti ekleyin ve nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika katılaşmaya bırakın.
   2. Kolajen jel yöntemi için: 30 mm'lik bir iç zar ekine 1 mL Kollajen jeli ( Tablo 1'e bakınız) ekleyin. Jelin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika katılaşmasına izin verin.
2. L-WRN şartlandırılmış ortamı¹⁵ hazırlayın. L-WRN şartlandırılmış ortam, Wnt3a, R-spondin 3 ve Noggin'i hücre kültürü için yaygın olarak kullanılan tek bir şartlandırılmış ortama salgılamak için tasarlanmış bir L-WRN hücre hattından üretilir.
   1. 37 ° C su banyosunda bir L-WRN hücresi kriyotüpünü çözün. 15 mL'lik konik bir tüpe 5 mL L hücreli ortam (bakınız Tablo 1) ve L-WRN hücre süspansiyonu ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 120 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini yeniden süspanse etmek için altta ~ 500 μL kaldığından emin olun.
   2. Süpernatanttaki hücre peletini buz üzerinde 30 mL L hücreli ortama aktarın ve 150 μL higromisin (500 μg/mL) ve 300 μL G418 (500 μg/mL) ekleyin. Hücreleri bir T-150 şişesi üzerinde 3 × 10:⁶ yoğunlukta tohumlayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ile ~% 90 birleşene kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
   3. Hücreler ~% 90 birleştiğinde, 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayarak, aspire ederek ve 3 mL tripsin ikamesi ile sindirerek hücreleri beş T-150 şişesine bölün. 5 dakika sonra, 9 mL L hücreli ortam ile nötralize edin ve ardından 4 ° C'de 120 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. ~%100 birleştiğinde, beş T-150 şişesini 10 T-175 3 katmanlı şişeye bölün.
   4. Bir kez birleştikten sonra, hücreleri 2 x 50 mL PBS ve ardından 25 mL yıkama ortamı ile yıkayın (bkz. Tablo 1).
   5. Her bir T-175 3 katmanlı şişeye 75 mL birincil kültür ortamı ekleyin ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 3 gün inkübe edin (bakınız Tablo 1).
   6. 3 gün sonra, şartlandırılmış ortamı 50 mL'lik bir konik haline getirin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.100 × g'da döndürün. Süpernatanı (şartlandırılmış ortam) toplayın ve 5 mL'nin geride kalmasını sağlayın.
   7. Her bir T-175 3 katmanlı şişeye taze 75 mL birincil hücre kültürü ortamı ekleyin ve ek şartlandırılmış ortam toplamak için 3 gün daha inkübe edin.
   8. Toplanan şartlandırılmış ortama, eşit hacimde birincil hücre kültürü ortamı (% 50 hacim) ekleyin ve içeriği 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak vakumla filtreleyin. Alikotları 50 mL'lik tüplerde saklayın ve uzun süreli kullanım için -20 °C'de veya 2-3 haftaya kadar 4 °C'de saklayın. Organoid kültür ortamını desteklemek için bu ortamı kullanın (bakınız Tablo 1).
      NOT: Kullanmadan önce alikotları gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
3. Hücresel karışımın taze melanom dokusundan toplanması
   1. Taze rezeke edilmiş melanom dokusunu, yıkama ortamı içeren 10 mL'lik bir Petri kabında yıkayın. İlk durulamadan sonra, tümörü daha fazla yıkama için ikinci bir Petri kabına aktarmak için steril cımbız kullanın ve tümör bütünlüğünü ve canlılığını korumak için bu işlemi buz üzerinde 3 kez tekrarlayın. Bu durulama döngüleri boyunca, fazla bağ dokusunu, yağı ve kalan kanı çıkarmak için steril makas ve bir bıçak kullanın. Üç yıkamadan sonra, tümörü boş bir Petri kabına koyun ve ince kıymak için steril bıçaklar kullanın.
      NOT: Kıyma işleminden sonra tümör jel benzeri bir kıvam göstermelidir. Tümörün kıyılması ne kadar ince olursa, hücre verimi o kadar yüksek olacaktır. Bunun nedeni, tümörün daha büyük kümelerinin sindiriminin daha zor olması ve sonraki adımda 70 μm Naylon hücre süzgecinden geçememesidir.
   2. Tümör dokusu iyice yıkandıktan ve kıyıldıktan sonra, 10 mL hazırlanan sindirim ortamı içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın (bakınız Tablo 1). Koniği 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin ve içeriğin her 5 dakikada bir girdaplanmasını sağlayın.
   3. 25 dakika sonra, sindirimi durdurmak için% 10 FBS içeren ADMEM / F12 ortamından 30 mL ekleyin.
      NOT: Bu belirtilen miktarlar, 0,2 g'dan daha ağır olmayan tümörler için tasarlanmıştır.
   4. Sindirilmiş hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir Naylon hücre süzgecinden süzün, ardından süzgeci %10 FBS içeren ADMEM/F12 (1x) Azaltılmış Serum Ortamı (1:1) ile durulayın. Yıkama adımını takiben, mümkün olan en yüksek sayıda hücrenin alındığından emin olmak için filtrenin altında kalan ortamı almak için bir pipet kullanın. Daha sonra 300 × g'da 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin (bakınız Tablo 1).
   5. Melanom tek hücreli süspansiyonunu Matrigel veya kollajen kültür sistemlerinde kültürleyin:
      1. Matrigel: 200 μL organoid kültür ortamı ile desteklenmiş önceden ısıtılmış Matrigel kaplı kuyucuklarda yaklaşık 2 × 10⁵ hücrenin tohumlandığından emin olmak için tek hücreli süspansiyonu sayın.
         NOT: Matrigel bazlı organoidler, patofizyolojiyi incelemek, ilaç etkinliğini taramak ve ilaç toksisitesini test etmek için kullanılır¹⁶.
      2. Kollajen jeli: Yaklaşık 10⁶ hücrenin 1 mL kollajen jeli ile karıştırıldığından emin olmak için tek hücreli süspansiyonu sayın. Karışımı önceden katılaşmış kollajen jel membran eklerine ekleyin ve bunları 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Hücreleri ve kollajen jeli içeren ekleri batırmak için yeterli organoid kültür ortamı ekleyin.
         NOT: Kollajen jel organoidleri, T hücresi göçünü ölçmek ve doku gelişimini incelemek^{için kullanılır 16}.
   6. Her 3 günde bir taze ortamın eklenmesini sağlarken organoidlerin büyümesine izin verin.
   7. Organoidleri 150-200 μm boyuta ulaştıklarında geçirin veya daha fazla kullanıma kadar dondurarak saklayın.
      1. Organoidlerin geçişi için, organoidleri 15 mL'lik bir konik içine aktarın ve 1x DPSB ile yıkayın. Karışımı 300 × g'da 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca tripsin ikamesi (organoid başına 50-100 μL) ekleyin ve içeriğin her 3 dakikada bir girdaplanmasını sağlayın.
      2. % 10 FBS içeren ADMEM / F12 (1x) Azaltılmış Serum Ortamı (1: 1) ortamı kullanarak sindirimi durdurun. Karışımı 300 × g'da 7 dakika santrifüjleyin ve organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin.
      3. Tek hücreli süspansiyonu, aynı başlangıç tohumlama yoğunluğunda yeni bir Matrigel / Kollajen kaplı kuyucuğa tohumlayın (48 oyuklu bir plakada Matrigel kaplı oyuklar için 200 μL organoid kültür ortamında 2 ×^{10 5} hücre veya kollajen kaplı 30 mm iç zar eki için 1 mL organoid kültür ortamında 10⁶ hücre).
      4. Kriyoprezervasyon için, tripsin ikamesini kullanarak MPDO'ları tek hücreli süspansiyonlara sindirin, ardından 10⁶ hücrenin 1 mL dondurma ortamına yeniden süspansiyonu yapın (bkz. Tablo 1).

Sonuçlar

MPDO'ların şekli ve boyutu, büyüme dinamiklerini incelemek için zaman içinde izlendi. Şekil 2'de görüldüğü gibi, ilk büyüme periyodu sırasında, organoid boyutu gösterilen 7 gün boyunca önemli ölçüde artmıştır. MPDO büyüme dinamiklerinin gözlemlenmesinin ardından, dikkat, organoidlerin orijinal tümörlere sadık bir şekilde özetlenmesini doğrulamak için bağışıklık hücresi bileşiminin değerlendirilmesine çevrildi. Ön...

Tartışmalar

PDO'ların ortaya çıkışı, daha önce kurulmuş diğer kanser araştırma yöntemlerinin ortaya çıkardığı çoklu sınırlamaları ele alırken, bu alanda dönüştürücü potansiyel uygulamaları tanıtmıştır. Bu organoid teknolojisi ilk olarak 2009 yılında, farelerin bağırsağından türetilen Lgr5 ⁺ kök hücrelerini, R-sponsin, EGF ve Noggin faktörleri²⁰ içeren bir 3D matris jelinde kültürleyerek başarılı bir şekilde bir bağ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021