Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

Özet

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Özet

Isı şoku proteini 70 (Hsp70), hücre içindeki diğer proteinlerin katlanmasını kolaylaştıran ve onu moleküler bir şaperon yapan korunmuş bir proteindir. Hsp70, normal koşullar altında büyüyen E. coli hücreleri için gerekli olmasa da, bu şaperon yüksek sıcaklıklarda büyüme için vazgeçilmez hale gelir. Hsp70 yüksek oranda korunduğundan, çeşitli türlerden Hsp70 genlerinin şaperon fonksiyonunu incelemenin bir yolu, onları Hsp70'te eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir Hsp70'i eksprese eden E. coli suşlarında heterolog olarak ifade etmektir. E. coli dnaK756 hücreleri, λ bakteriyofaj DNA'sını destekleyemez. Ayrıca, doğal Hsp70 (DnaK), GrpE (Hsp70 nükleotid değişim faktörü) için azalmış afinite gösterirken yüksek ATPaz aktivitesi sergiler. Sonuç olarak, E. coli dnaK756 hücreleri, 30 °C ila 37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yeterince büyür, ancak yüksek sıcaklıklarda (>40 °C) ölürler. Bu nedenle, bu hücreler Hsp70'in şaperon aktivitesini incelemek için bir model görevi görür. Burada, Hsp70'in selülo şaperon fonksiyonunun incelenmesini sağlayan bir tamamlama testi yapmak için bu hücrelerin uygulanması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Giriş

Isı şoku proteinleri, protein katlanmasını kolaylaştırarak, protein agregasyonunu önleyerek ve protein yanlış katlanmasını tersine çevirerek moleküler şaperonlar olarak önemli bir rol oynar ^1,2. Isı şoku proteini 70 (Hsp70), protein homeostazında merkezi bir rol oynayan en önemli moleküler şaperonlardan biridir ^3,4. DnaK, E. coli Hsp70 homologu^5'tir.

Hsp70'in şaperon aktivitesini araştırmak ve bu şaperon ^6,7,8'i

Protokol

1. Dönüşüm

NOT: Kültür, pipet uçları ve yeni hazırlanmış ve otoklavlanmış ortamlar için steril cam eşyalar kullanın. 2x maya triptonunda (YT) [% 1.6 tripton (a / v),% 1.6 maya özütü (a/v),% 0.5 NaCl (a / v),% 1.5 agar (a / v)] agarda E. coli hücrelerinin kültürlerini hazırlayın. Protokolde kullanılan genel reaktifler ve kaynakları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve hücreleri buz üzerinde tutarak 50 μL yetkin E. coli dnaK756hücrelerini ayırın.
2. Yetkin hücrelere sahip 2.0 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine, 10-50 ng pQE60 / DnaK, pQ....

Tartışmalar

Protokol, heterolog olarak eksprese edilen Hsp70'in şaperon fonksiyonunu araştırmada E. coli dnaK756hücrelerinin faydasını göstermektedir. Bu test, selülde Hsp70 fonksiyonunu hedefleyen inhibitörleri taramak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, E. coli'de DnaK'nin yerini alamayan Hsp70'lerin bu testle uyumlu olmamasıdır. Bazı doğal olmayan Hsp70'lerin translasyon sonrası modifikasyon²¹ eksikliği, E. coli sistem.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody