İzole, Basınçlı Lenf Damarlarında Mutlak, Sitosolik, Serbest Ca2+ ve Karşılık Gelen Kontraktilitenin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

Özet

Bu protokol, kasılan lenf damarlarında sitosolik, serbest kalsiyum [Ca^{2 +}] _i ve damar çapını gerçek zamanlı olarak ölçmek ve ardından mutlak Ca²⁺ konsantrasyonlarının yanı sıra kasılma / ritmiklik parametrelerini hesaplamak için bir yöntemi tanımlar. Bu protokol, çeşitli deneysel koşullarda Ca²⁺ ve kasılma dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Şimdi sıklıkla "üçüncü dolaşım" olarak adlandırılan lenfatik damar sistemi, birçok hayati organ sisteminde bulunur. Lenfatik vaskülatür sisteminin temel mekanik işlevi, sıvıyı hücre dışı boşluklardan merkezi venöz kanallara geri döndürmektir. Lenf taşınmasına lenf damarlarının (LV'ler) spontan ritmik kasılmaları aracılık eder. LV kasılmaları büyük ölçüde sitosolik, serbest kalsiyumun ([^Ca2+]_i) döngüsel yükselişi ve düşüşü ile düzenlenir.

Bu makale, izole, basınçlı LV'lerde gerçek zamanlı olarak [Ca²⁺]_i'nin mutlak konsantrasyonlarındaki ve damar kasılması/ritmikliğindeki değişiklikleri eşzamanlı olarak hesaplamak için bir yöntem sunmaktadır. İzole sıçan mezenterik LV'leri kullanarak, ilaç ilavesine yanıt olarak [Ca^{2 +}] _i ve kasılma / ritmiklikteki değişiklikleri inceledik. İzole edilmiş LV'ler, oransal Ca²⁺ algılama göstergesi Fura-2AM ile yüklendi ve [Ca²⁺]_i ve çap ölçümlerini gerçek zamanlı olarak sürekli olarak yakalamak için kenar algılama yazılımı ile birleştirilmiş video mikroskobu kullanıldı.

Her bir LV'den gelen Fura-2AM sinyali, her gemi için minimum ve maksimum sinyale kalibre edildi ve mutlak [Ca²⁺]_i'yi hesaplamak için kullanıldı. Çap ölçümleri, kasılma parametrelerini (amplitüd, diyastolik son çap, sistolik çap sonu, hesaplanan akış) ve ritmisiteyi (frekans, kasılma süresi, gevşeme süresi) hesaplamak için kullanıldı ve mutlak [Ca²⁺]_i ölçümleri ile ilişkilendirildi.

Giriş

Lenfatik damar sistemi beyin, kalp, akciğerler, böbrek ve mezenter 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere birçok organ sisteminde bulunur ve sıvı homeostazını sürdürmek için sıvıyı (lenf) interstisyel boşluklardan merkezi venöz kanallara iterek çalışır 7,8,9,10 . Toplayıcı lenf damarlarına (LV'ler) boşalan vasküler kılcal yataklar içindeki kör uçlu lenfatik kılcal damarlarla başlar. Toplayıcı LV'ler iki hücre katmanından oluşur: bir lenfatik kas hücresi tabakası (LMC'ler) tarafından kapsanan bir endotel hücreleri ^{tabakası10,11}. Lenf sıvısı taşınması hem dışsal kuvvetler (ör. yeni lenf oluşumu, arteriyel pulsasyonlar, merkezi venöz basınç dalgalanmaları) hem de içsel kuvvetler¹² yoluyla sağlanır.

Lenf transportu için içsel kuvvet, lenfatik fonksiyonu araştıran çalışmaların çoğunun odak noktası olan toplayıcı LV'lerin spontan ritmik kasılmasıdır. Bu intrinsik lenfatik pompa esas olarak sitosolik, serbest Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}] _i) nin döngüsel yükselişi ve düşüşü ile düzenlenir. LMC'lerde plazma membranının spontan depolarizasyonu, voltaj kapılı "L-tipi" Ca²⁺ (Ca_v1.x) kanallarını aktive ederek Ca²⁺ akışını ve ardından LV ritmik kasılmasını^{tetikler 8,9,10}. Bu rol, LV kasılmalarını inhibe eden ve damar genişlemesine neden olan nifedipin gibi spesifik ajanlarla Ca_v1.x'i bloke ederek gösterilmiştir^13,14. Ca_v1.x kanallarının aracılık ettiği LMC'lerde [Ca^{2 +}] _i veya "Ca^{2 +} spike" deki geçici artış, sarkoplazmik retikulum (SR) üzerindeki inositol trifosfat (IP₃) reseptörlerini ve ryRs reseptörlerini (RyR'ler) aktive ederek hücre içi Ca^{2 +} depolarını da harekete geçirebilir15,16,17,18. Mevcut kanıtlar, IP₃ reseptörlerinin RyRs^{15,16,19,20,21'e} kıyasla normal LV kasılmaları için gereken Ca^{2 +} 'ya daha fazla katkıda bulunduğunu göstermektedir; bununla birlikte, RyR'ler patoloji sırasında veya farmasötik müdahaleye yanıt olarak rol oynayabilir^17,18. Ek olarak, Ca²⁺ ile aktive edilen K ⁺ kanallarının²² ve ATP'ye duyarlı potasyum (K_ATP) kanallarının^23,24 aktivasyonu, LMC membranını hiperpolarize edebilir ve spontan kasılma aktivitesini inhibe edebilir.

LV'lerin toplanmasında Ca²⁺ dinamiklerini düzenleyebilen birçok başka iyon kanalı ve protein vardır. Farmakolojik ajanlara gerçek zamanlı olarak yanıt olarak Ca²⁺ ve damar kontraktilitesindeki değişiklikleri incelemek için yöntemler kullanmak, bu potansiyel düzenleyicileri anlamak için önemlidir. LV [Ca^{2 +}_] i'deki nispi değişiklikleri ölçmek için Fura-2'yi kullanan daha önceki bir yöntem tarif edilmiştir²⁵. Fura-2 ve Ca²⁺ için ayrışma sabiti²⁶ olarak bilindiğinden, bu yöntemin uygulamasını genişleten ve Ca²⁺ sinyali, membran uyarılabilirliği ve kasılma mekanizmaları²⁷ hakkında ek bilgi sağlayan gerçek Ca²⁺ konsantrasyonlarını hesaplamak mümkündür, ayrıca deney grupları arasında temel karşılaştırmalara izin verir. Bu ikinci yaklaşım kardiyomiyositler^28'de kullanılmıştır ve bu nedenle LV'lere uyarlanabilir. Bu makale, izole edilmiş, basınçlı LV'lerde mutlak [Ca²⁺]_i'deki değişiklikleri ve ayrıca damar kasılmalarını/ritmikliğini sürekli olarak gerçek zamanlı olarak ölçmek ve hesaplamak için bu iki yaklaşımı birleştiren gelişmiş bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca nifedipin ile tedavi edilen LV'ler için temsili sonuçlar da sağlıyoruz.

Protokol

Dokuz ila 13 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları ticari bir satıcıdan satın alındı. Varıştan sonra, tüm sıçanlar standart bir laboratuvar diyetiyle Arkansas Üniversitesi Tıp Bilimleri (UAMS) Laboratuvar Hayvan Tıbbı Bölümü (DLAM) tesisinde barındırıldı ve tutuldu ve 25 ^{° C'de}12 saat aydınlık: karanlık döngüsüne maruz bırakıldı. Tüm prosedürler, UAMS'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış hayvan kullanım protokolü #4127'ye göre gerçekleştirilmiştir.

1. Mezenterik LV'lerin diseksiyonu ve kanülasyonu

NOT: Deneyi bozacak herhangi bir akış kesintisi veya sızıntı olmadığından emin olmak için mezenterik LV'lerin izolasyonundan önce perfüzyon odasının kurulması önemlidir.

1. Perfüzyon banyosu hazırlığı
   1. Ticari bir satıcıdan borosilikat cam mikropipetler (1,2 mm dış çap, 0,68 mm iç çap ve 75-100 μm dış uç çapına çekilmiş) satın alın. İzole edilmiş damar perfüzyon odasına monte etmek için mikropipetleri (diğer adıyla kanül) yaklaşık 1-2 cm uzunluğunda kesin ve parlatın.
   2. Kap perfüzyon odasına monte edilmiş her bir cam kanülü, polietilen boru kullanarak bağımsız yerçekimi beslemeli basınç regülatörleri ile aynı hizada yerleştirilmiş bağımsız basınç transdüserlerine bağlayın.
      NOT: Bu, çalışma tasarımına bağlı olarak giriş ve çıkış basınçlarının bağımsız olarak manipüle edilmesine izin verir. Şekil 1'de bu kurulum ayrıntılı olarak gösterilmektedir.
   3. Perfüzyon odasını (5 mL), cam mikropipetleri ve bağımsız yerçekimi beslemeli basınç regülatörünü polietilen boru ile birlikte fizyolojik tuz çözeltisi (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1.17mM NaH₂PO₄; 4.7 mM KCl; 1.17 mM MgS04; 5.5 mM C₆H₁₂O₆ (glikoz); 0.026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); ve 1.6 mM CaCl₂) herhangi bir hava kabarcığı içermez. Ardından, kanüllere basınç uygulanmaması için basıncı sıkıştırın.
      NOT: Bu çözeltinin pH'ı ~ 7.5'tir. Adım 1.3.7'de açıklandığı gibi PSS içindeki bikarbonat tamponlama sistemine etki etmek için CO₂ köpürmesi kullanılarak perfüzyon banyosunda 7.4'lük bir pH korunur. EDTA burada fazla Ca²⁺ iyonlarını şelatlamak için kullanılır.
2. Düğümlerin hazırlanması
   1. Mikroskop altında örgülü ipek dikiş ipliği (8-0 numara) kullanarak çift el üstü düğüm atın. Temel adımlar Şekil 2'de gösterilmiştir.
      1. Tek bir filamenti ayırın.
      2. Mikrokünt uçlu iki Dumont # 5 forseps kullanın ve bir forseps kullanarak diğer forsepsin ucunun etrafında çift halka yapın.
      3. İlmekli forseps ile dikişin gevşek ucunu tutun ve düğümü tamamen kapalı çekmemeye ve küçük bir açıklık bırakmamaya dikkat ederek her iki halkadan da çekin.
      4. Her iki taraftan fazla dikişi kesmek için Vanna yaylı makas kullanın. LV'yi kanüllere sabitlemek için bu düğümleri daha sonra kullanın.
         NOT: Düğüm atma sırasında forseps uçlarına zarar verme tehlikesi daha fazla olduğundan, diseksiyon yapacağınız veya kanül yapacağınız aynı forsepsleri kullanmayın.
3. Mezenterik LV'lerin izolasyonu ve kanülasyonu
   1. 1.5 L / dak O₂ doz aşımı ile% 5'lik bir izofluran uygulayarak hayvanları derinlemesine uyuşturun ve dekapitasyon ile kan kaybedin.
   2. Mezenterik LV'lerin diseksiyonu için önce karın duvarının orta hattı boyunca uzunlamasına bir kesim yaparak, mezenteri dıştan çıkararak ve ardından pilor sfinkterinin hemen altında ve çekumun ~ 2-3 cm üzerinde bağlantıyı keserek ve ayrıca rektuma olan bağlantıyı keserek tüm mezenterleri izole edin.
   3. Diseke edilmiş bütün mezenterleri 200 mL buz gibi soğuk PSS'de yıkayın ve daha sonra buz gibi soğuk PSS içeren silikon kaplı (8-10 mm) bir Petri kabına (100 mm) aktarın ve sabitleyin.
   4. Bir stereomikroskop, diseksiyon Dumont # 5 Inox ince forseps ve Vanna yaylı makas kullanarak çevredeki yağ ve bağ dokusundan ikinci dereceden mezenterik LV'leri inceleyin. Dokudan çıkarıldıktan sonra LV'lerin uçlarını tanımlamaya yardımcı olmak için, LV'nin proksimal ucunda küçük bir yağ parçası bırakın.
   5. Diseke edilen LV'leri cam kanüller üzerinde kanülasyon için damar perfüzyon odasına aktarın.
   6. Lenf akış yönünü taklit etmek için LV'nin distal ucu P1 kanülü (giriş) ve damarın proksimal ucu P2 kanülü (çıkış) üzerinde olacak şekilde LV'leri kanül etmek için iki önceden keskinleştirilmiş Dumont #5 Inox Fine Forseps, düz uçlu (0.05 x 0.01 mm) kullanın.
      NOT: P1 ve P2 kanülleri aynıdır ve yalnızca AG'nin hangi ucunun bağlı olduğuna göre farklılık gösterir. İnce damar duvarının tutulmasını kolaylaştırmak için uçta mükemmel bir şekilde buluşan ve hasarsız forsepslerin kullanılması önemlidir.
      1. Daha sonra kabı kanüllere sabitlemek için her bir cam kanülün üzerine önceden hazırlanmış tek bir düğüm kaydırın.
      2. LV yönünü yönlendirmeye yardımcı olmak için küçük bir yağ parçası kullanarak, önce distal ucu P1'e kanüle edin.
      3. Düğümü kanülden aşağı kaydırın ve LV'yi sabitlemek için sıkın. Kanül ucunu aşırı sıkmamaya ve kırmamaya dikkat edin.
      4. Perfüzyon odasında AG'yi 4-5 mm Hg'ye kadar basınçlandırın.
         NOT: Amaçlarımız için, P1 ve P2 basıncını eşit olacak şekilde ayarladık; Bununla birlikte, deneysel koşullara bağlı olarak, basınç, kesme gerilimi veya geri akışı indüklemek için her kanülde ayarlanabilir.
      5. LV'nin proksimal ucunu P1.3.6.1 üzerine kanüle etmek için 1.3.3.6.4-2 adımlarını tekrarlayın.
   7. Fizyolojik pH'ı korumak için %7 karbondioksit (CO₂) /% 93 oksijen (O₂) içeren köpüren taşı banyo odasına yerleştirin.
   8. Odayı sıcaklık regülatörüne bağlayın ve LV'lerin dengelenmesi ve kararlı, kendiliğinden kasılmalar geliştirmesi için 37 ^°C'ye ayarlayın (yaklaşık 30 dakika).
      NOT: Şekil 1'de bu kurulum ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

2. LV'lerde [Ca^{2 +}] _i'nin mutlak konsantrasyonlarının ölçümü

1. Kanüllü LV'lerin fura-2AM boyaması
   1. Spontan kasılmalar geliştikten sonra (adım 1.3.8'den itibaren), LV'leri Fura-2-asetoksimetil ester (Fura-2AM; 2 μM veya 10 μL / 5 mL) ve pluronik asit (PA;% 0.02 W / V veya 5 μL / 5 mL% 20 PA) ile karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Fura-2AM'nin eklenmesinden sonra, kalan tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
   2. 30 dakika sonra, tüm banyo hacmini negatif basınçlı bir vakumla boşaltarak ve sıcaklığa uygun (37 ^oC) reaktif içermeyen PSS ile değiştirerek perfüzyon odasındaki çözeltiyi 3x değiştirin.
      NOT: Bu, AG'nin havada asılı kalma süresini en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Örneğin, vakum için sağ elinizi ve yeni reaktif içermeyen PSS'yi değiştirmek için sol elinizi kullanın.
   3. Yıkadıktan sonra, fazla indikatörü çıkarmak ve deesterifikasyona izin vermek için LV'leri karanlıkta 15 dakika inkübe edin.
2. Ca'yı Yakalamak²⁺ Floresan ve damar çapı
   1. Odayı, bir LED ışık kaynağı, bir 20x S Fluor objektif, bir hücre çerçeveleme adaptörü ve 15 Hz'de kare kare floresan yakalamayı sağlayan hızlı bir CMOS video kamera sistemi ile donatılmış ters çevrilmiş floresan mikroskop sahnesine aktarın.
      NOT: Bu iş akışı kurulumunun bir şeması Şekil 3'te sunulmuştur. Ca²⁺ sinyali, en az 15 fps'lik bir CCD kamera kullanılarak yakalanabilir.
   2. Floresan ve kenar algılamayı kaydetmek için mikroskobu görüntüleme yazılımıyla donatılmış bilgisayara bağlayın.
      NOT: Referans verilen yazılım aynı zamanda eşzamanlı basınç kaydını da mümkün kılar; Ancak, bu buraya dahil değildir.
   3. LED ışık kaynağını ve Floresan Sistem arayüzünü açın.
      NOT: Burada açıklanan yazılım talimatları, başvurulan yazılım içindir, ancak bu verileri elde etmek için başka yazılımlar da kullanılabilir.
   4. Yazılımı açın (IonWizard).
   5. Dosya sekmesi altında Yeni'yi seçin.
   6. Topla sekmesi altında Deneme'yi seçin.
   7. İstediğiniz deneysel şablonu yükleyin ve Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Ölçülecek parametrelerle bir deney şablonu oluşturmanız gerekecektir. Şablon kurulum talimatları yazılım kılavuzunda^{bulunabilir 29}.
   8. Damar Çapı, Pay (340 sinyali), Payda (380 sinyali) ve Oranı azalan sırada görmek için ekrandaki izleri ayarlayın.
   9. İzleri görselleştirmeye yardımcı olmak için y ekseni ölçeğini gerektiği gibi ayarlayın.
      1. İzlemeler'in altında, Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçin. Otomatik Limitler'in işaretli olmadığından emin olun.
      2. Ayarlamak istediğiniz parametreyi seçin, eksen için minimum ve maksimum değerleri girin ve ardından Tamam'ı seçin.
   10. Denemeye başlamak için BAŞLAT'a tıklayın (ekranın alt kısmında).
   11. LV çapını aynı anda ölçmek için, görüntüleme sistemine dahil edilen ve 3 Hz'de LV'lerin kasılma izlerini oluşturan kenar algılama yazılımını kullanın. Bölüm 3'te açıklanan ve Şekil 4'te gösterilen kasılma ve ritmiklik parametrelerini analiz etmek için bu ölçümleri kullanın.
       1. Aydınlatmayı, AG duvarı koyu çizgiler olarak görünecek şekilde ayarladığınızdan emin olun.
       2. Yağ ve kalıntı içermeyen bir ilgi alanı (ROI) seçin. Deneme başladıktan sonra bu ROI'yi taşımayın.
       3. Eşiğin, tüm kasılma döngüsü boyunca damar duvarı kenarı algılanacak şekilde ayarlandığından emin olun.
   12. Floresan ölçümleri için Fotoçoğaltıcı Tüpü (PMT) açın.
   13. LED aydınlatıcılar kullanarak 50 ms'lik pozlamalarda 340 ve 380 nm dalga boylarını değiştirerek oransal bir gösterge olan Fura-2'yi uyarın ve tüm görüntüleme alanı boyunca 15 Hz'de 510 nm'de emisyon spektrumlarını yakalayın.
       NOT: Tekrarlanabilir Ca²⁺ ölçümleri elde etmek için tüm optik parametrelerin (uyarma ayarları, emisyon filtreleri, objektif lens ve dikroik aynalar) tüm deney serisi için aynı tutulması önemlidir.
   14. Sinyal-arka plan oranını, önce LV görüş alanının (sinyal) ortasındayken 340 ve 380 floresansı elde ederek ve ardından sahne manipülatörlerini kullanarak görüş alanını kap olmadan banyonun kenarına taşımak için (silikon kaplı kenardan kaçınmaya dikkat ederek ve/veya banyodaki kalıntıları temizleyerek) ölçün.
       NOT: Ca²⁺ ölçümleri için her seferinde kabın orijinal bölümüne geri dönmek önemlidir.
   15. Banyodaki fazla göstergeyi gidermek için banyo solüsyonunu sıcaklığa uygun reaktif içermeyen PSS ile değiştirin. Fazla Fura-2'yi çıkarmak için birkaç banyo değişimi gerekebilir, bu nedenle sinyal-arka plan oranı yaklaşık 10:1 olana kadar bu değişimi tekrarlayın.
   16. Başlangıç Fura-2 floresan sinyalini ve spontan kasılmaları yaklaşık 30 dakika boyunca kaydedin, ardından voltaja bağlı bir Ca_v1.x antagonisti olan nifedipinin (NIF; 0.1-100 nM) kümülatif konsantrasyon tepkisi izleyin. Her ilaç konsantrasyonu için arka plan ölçümleri alın.
   17. Her deneyin sonunda, Ca 2+ yokluğunda minimum Fura-2 floresan sinyalini (R_min) ve LV'lerin maksimum çapını elde etmek için LV'leri sıcaklığa uygun Ca²⁺ içermeyen PSS ile yıkayın. Arka planı ölçtüğünüzden emin olun.
       NOT: Ca²⁺ içermeyen PSS, PSS ile aynı bileşime sahiptir ancak CaCl₂ içermez ve EDTA, 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~ 7.5) ile değiştirilir.
   18. Doymuş Ca²+ koşullarında maksimum Fura-2 floresan sinyalini (R_max) ve LV'lerin minimum çapını elde etmek için banyo solüsyonunu 10 mM Ca²⁺ ve iyonomisin (10 μM IONO), bir Ca²⁺ iyonoforu içeren sıcaklığa uygun PSS ile değiştirin. Arka planı ölçtüğünüzden emin olun.
3. Mutlak ölçme formülü [Ca²⁺]_i
   1. 340 ve 380 nm dalga boylarının oranını kalibre etmek ve mutlak sitozolik serbest Ca²⁺ konsantrasyonunu ([Ca^{2 +}] _i) hesaplamak için R_min ve R_max kullanın.
   2. Denklem (1)^26'yı kullanarak mutlak sitozolik serbest Ca^{2 +} konsantrasyonunu ([Ca^{2 +}] _i) hesaplayın:
      (1)
      K_d = 225 nM (Fura-2 için ayrışma sabiti)²⁶, R = 340/380 oranı, R_min = 340/380 oranı Ca²⁺ yokluğunda, R_max = 340/380 oranı doymuş Ca²⁺ koşullarıyla, S_serbest = 380 sinyali Ca²⁺ yokluğunda, S_bağlı = 380 sinyali doygun Ca²⁺ koşullarıyla
      NOT: Tüm floresan sinyaller arka plan floresansı için düzeltilmiştir.
   3. Şekil 5, hangi parametrelerin kaydedildiğini detaylandıran bir örnek Ca²⁺ izidir. Taban çizgisi Ca²⁺'yı Ca²⁺ artışından önceki en düşük dinlenme Ca²⁺ ve tepe Ca²⁺ Ca 2⁺ artışı sırasında elde edilen en yüksek Ca²⁺ olarak tanımlayın. Genlik, Tepe ve Taban Çizgisi Ca²⁺ arasındaki farktır. Çevrimdışı olarak Ca²⁺ ani artış/sn sayısı olarak hesaplanacak olan Ca²⁺ ani yükselme sıklığı dışında tüm parametreleri doğrudan görüntüleme yazılımından dışa aktarın. Aşağıda, bu parametreleri elde etmek için başvurulan yazılımdaki temel adımlar verilmiştir.
      NOT: Tüm izler bir .txt dosyasına aktarılabilir ve tüm parametreler tercih ettiğiniz yazılımda analiz edilebilir veya hesaplanabilir.
   4. R_min için, Ca²⁺ içermeyen PSS sırasında arka plana karşılık gelen Pay izlemesinin bölümünü vurgulayın. Bir iletişim kutusu açılır ve izlemenin bu bölümü için değerler sağlanır.
   5. İşlemler'in altında Sabitler'i seçin.
   6. Kalsiyum-Sayısal arka planı seçin ve önceki adımdan Pay ve Payda için arka plan numaralarını girin. Tamam'a tıklayın.
   7. Oran izlemesinin, Ca²⁺ içermeyen PSS sırasında en düşük orana karşılık gelen bölümünü vurgulayın. Bu R_dk. Ayrıca bu bölüm için Payda değerini de not edin; bu S_ücretsizdir.
   8. 2.3.4 ile 2.3.7 arasındaki adımları, izlemenin yüksek Ca₂⁺ serbest PSS'ye ve en yüksek orana karşılık gelen bölümüyle_bağlı olarak R max ve S için tekrarlayın.
   9. İşlemler'in altında Sabitler'i seçin.
   10. Kalsiyum-Kalsiyum Kalibrasyonu'nu seçin ve Denklem 1'de listelenen değerleri girin. Tamam'a tıklayın.
   11. Ekrandaki izlerden birini Adım 2.2.8'de açıklandığı gibi ayarlayın , böylece Kalsiyum-Sayısal çıkarılmış Kalsiyum'u görebilirsiniz.
   12. Kalan parametreleri elde etmek için Monotonik Geçici Olay Analizi gerçekleştirin. Bunun için talimatlar yazılım kılavuzunda³⁰ bulunabilir.
   13. Alternatif olarak, Dışarı Aktar'ın altında Geçerli İzleme'yi seçin.
   14. .txt dosyasını dışa aktarmak istediğiniz konumu seçin ve Tamam'a tıklayın.
       NOT: Dışa aktarmak istediğiniz tek tek ize tıkladığınızdan emin olun. İzlemenin tamamını veya izlemenin seçili bölümlerini dışa aktarabilirsiniz.

3. AG kasılma ve ritmikliğinin ölçülmesi

1. Görüntüleme sistemine dahil edilen kenar algılama yazılımı, yukarıda açıklandığı gibi AG çapı ölçümleri için kasılma izleri oluşturur. Kasılma ve ritmik parametreleri analiz etmek için bu ölçümleri kullanın. Şekil 4 , hangi kasılma parametrelerinin kaydedileceğini detaylandıran örnek bir kasılma izidir. Çevrimdışı olarak hesaplanacak olan kasılma sıklığı, hesaplanan akış ve aralık dışında, Çap izi^30'daki Monotonik Geçici Olay Analizi işlevini kullanarak tüm parametreleri doğrudan görüntüleme yazılımından dışa aktarın.
   NOT: Tüm izler bir .txt dosyasına aktarılabilir ve tüm parametreler aşağıdaki denklemler kullanılarak tercih ettiğiniz yazılımda analiz edilebilir veya hesaplanabilir.
2. EDD, ESD, genlik, frekans ve hesaplanan akış ölçümleri
   1. LV'lerin ritmik ve spontan kasılmaları sırasında elde edebilecekleri maksimum ve minimum çapları (sırasıyla diyastol sonu çapı [EDD] ve sistolik sonu çapı [ESD]) ölçün.
   2. Kasılmaların genliğini (AMP) EDD ve ESD arasındaki fark olarak hesaplayın.
   3. Frekansı, ölçüm periyodu başına kasılma sayısı (s cinsinden) olarak hesaplayın.
   4. Denklem (2) kullanarak μm başına hesaplanan akışı hesaplayın:
      Hesaplanan akış = π/4 (EDD²- ESD²) F (2)
      EDD² = gevşemiş durumda damar kesit alanı, ESD² = daralma sırasında damar kesit alanının ölçüsü, F = kasılma sıklığı/s
3. Ritmiklik: kasılma ve gevşeme süresi:
   1. LV ritmikliğinin diğer ölçümleri kasılma süresi ve gevşeme süresidir.
   2. Kasılma süresini, LV'nin her kasılmada ESD'ye ulaşması için geçen süre olarak tanımlayın.
   3. Gevşeme süresini, LV'nin her gevşeme için EDD'ye ulaşması için geçen süre olarak tanımlayın, bu da belirli bir zaman çerçevesi içinde mutlak [Ca²⁺]_i ile ilişkili genel bir ritmiklik göstergesi verecektir.
   4. Denklem (3)'ten aralık süresini (ΔT) hesaplayın.
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Tartışmalar

LV'lerin kırılgan ve küçültücü doğası nedeniyle, hem diseksiyon hem de kanülasyon süreçleri sırasında azami özen gösterilmesi zorunludur. Damardaki küçük hasar bile canlı olmayan bir LV'nin gelişmesine yol açabilir veya [Ca²⁺]_i geçici olaylarında anormalliklere yol açabilir. Uyarma ayarlarındaki tutarlılık, kontrol ve tedavi edilen gruplar arasında [Ca^{2 +}] _i ölçümlerinde karşılaştırılabilirliği sağlamak için tüm deney serisi boyunca eşit derecede önemlidir. Tekdüze ayarların sürdürülememesi, bir deney serisindeki gemiler arasında [Ca²⁺]_i'yi fazla veya küçümseme konusunda önemli bir risk oluşturur. Benzer şekilde, her deney boyunca aynı damar bölgesini doğru bir şekilde tanımlamak ve izlemek de aynı derecede önemlidir.

Oransal indikatör Fura-2AM'nin kullanımı, tek dalga boylu boyalarda yaygın olan düzensiz doku kalınlığı, florofor dağılımı/sızıntısı veya foto ağartma sorunlarının neden olduğu floresan değişimlerini normalleştirir. ³¹ Bu, bu protokolde açıklanan sürekli izlemeyi mümkün kılar. Bununla birlikte, Fura-2, Ca^{2 +} şelatlama ile çalıştığından, LV'leri aşırı yüklemek ve kasılma veya ilaç yanıtı için mevcut olan [Ca^{2 +}] _i'yi azaltmak mümkündür. Bu durumlarda, ritmik kasılmalar yokken Ca²⁺ sivri uçlar hala gözlenebilir. Değişen LV uzunluğu da bu fenomene katkıda bulunabilir. Bu Ca 2 + ölçümleri muhtemelen hala geçerli olsa da, hem Ca^{2 +} hem de çap ölçümlerini başarılı bir şekilde elde etmek için tekrarlanan kurulumlarda Fura-2AM konsantrasyonunu azaltmak gerekebilir. Sonuçlarımız yalnızca başlangıçta hem Ca^{2 +} sivri uçlarının hem de ritmik kasılmaların mevcut olduğu LV'leri içerir.

R_min ve R_max ölçümü, mutlak [Ca²⁺]_i'nin hesaplanmasında kritik adımlardır. R_min, Ca^{2 +} yokluğunda Fura-2 oranı olması gerektiğinden, herhangi bir kalıntı Ca 2⁺ 'nın şelasyonunu sağlamak için Ca^{2 +} içermeyen PSS'ye yüksek bir EGTA konsantrasyonu eklenmiştir. İlk çalışmalar, Ca^{2 + içermeyen} PSS'de EDTA ile gerçekleştirildi ve bu, karşılık gelen Ca^{2 +} sivri uçlarıyla sporadik damar kasılmaları ile sonuçlandı. R_max için, [Ca² +] _i sinyalini en üst düzeye çıkarmak için bir iyonofor, iyonomisin ile birlikte PSS'ye yüksek bir Ca^{2 +} konsantrasyonu eklenmiştir. Yüksek Ca^{2 +} çözeltisi çökelebilir ve bu da EDTA'nın PSS'den çıkarılmasını gerektirebilir. Daha da önemlisi, R_min ve R_max'ın bu ek ölçümleri, membran uyarılabilirliği ve kasılma mekanizmaları²⁷ hakkında bilgi sağlayabilen ve aynı zamanda Fura-2 için yalnızca 340/380 oranını bildiren protokollere kıyasla deney grupları arasında temel karşılaştırmalara izin veren [Ca^{2 +}] _i'deki fizyolojik olarak ilgili değişiklikleri değerlendirme fırsatı sağlar. Yeterli R_min ve R_max değerlerinin elde edilememesi, mutlak [Ca²⁺]i hesaplama yeteneğini engeller_.

LV'lerin kasılma doğası nedeniyle, bu yöntem felçli damarlarda ölçülebilen yerel Ca²⁺ salınım olaylarından ziyade yalnızca küresel Ca 2⁺ seviyelerinin bir ölçüsünü sağlayabilir³². Bununla birlikte, bu yöntem, felçli damarlar veya tek tek hücreler kullanan yöntemlere kıyasla mutlak [Ca²⁺]_i dinamiklerindeki değişiklikleri kasılma ile ilişkilendirmek için avantajlıdır^28,32. Bu yaklaşım için, ölçülen Ca^{2 +} 'nın çoğunluğunun lenf kası hücrelerinden kaynaklandığı varsayılmaktadır. Bununla birlikte, bu izole LV'lerde de bulunan endotel hücreleri, gözlenen toplam Ca²⁺ sinyaline katkıda bulunabilir³³. Bu katkı, endotel^34'ten arındırılmış LV'ler kullanılarak tahmin edilebilir. LV kasılmaları ayrıca kasılma döngüsü sırasında damar duvarının hafifçe odak içine ve dışına kaymasına neden olabilir. Bu nedenle, gergin ancak damarı germeden çekilebilen kısa damar segmentlerinin kullanılması önemlidir.

LV'lerdeki uygulamasının ötesinde, bu yöntem, arteriyoller ve damarlar dahil olmak üzere diğer vasküler yataklardan izole edilmiş damarları incelemek için kullanılabilir ve nörobiyoloji ve vasküler biyolojinin diğer dallarında potansiyel kullanım için umut vaat eder. Farklı sinyal iletim yollarını hedefleyen çeşitli agonistlerin veya antagonistlerin etkilerini keşfetmek, altta yatan Ca^{2 +} dinamiklerini araştırmak için başka bir yoldur. Ayrıca, bu teknik, ilgili hayvanlardan alınan kontrol ve muamele edilmiş numuneleri içeren karşılaştırmalı araştırmalar için de kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, perfüzyon odası ve mikroskop hedeflerinde minimum ayarlamalar gerektiren, izole edilmiş lenfatik kas hücreleri gibi hücresel düzeyde uygulama için uyarlanabilir. Özetle, bu yöntem, LV'lerdeki kasılma ve ritmiklik ile ilişkili olduğu için küresel Ca²⁺ dinamikleri hakkında fizyolojik olarak ilgili bilgiler sağlar ve LV'lerin toplanmasında Ca²⁺ dinamiklerinin potansiyel düzenleyicilerinin sağlam bir değerlendirmesini sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x S Fluor objective	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)	UPlanSApo
Borosilicate glass micropipettes	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)	GCP-75-100
Calcium chloride (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)	BP510-500
Carbon dioxide (CO2)	nexAir (Memphis, TN, United States)	UN3156
Dissection forceps	Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, United States)	F1221
Glucose (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)	D16-500
Gravity-Fed Pressure regulator	custom-made in the lab
Heating unit	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)	TC-09S
Imaging software	IonOptix (Westwood, MA, United States)
Inverted fluorescent microscope	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Waltham, MA, United States)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, United States)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Telangana, India)	NDC 66794-017-10
Isolated vessel perfusion chamber	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)	CH-1
Knot preparation forceps	Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)	11253-20
LED light source	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)	TL4
Magnesium sulfate (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Unites States)	213115000
MyoCam-S3 Fast CMOS video system	IonOptix (Westwood, MA, United States)	MCS300
Nifedipine	Sigma (St. Louis, MO, United States)	N7634
Ophthalmic sutures
Oxygen (O2)	nexAir (Memphis, TN, United States)	UN1072
Pluronic acid	Sigma (St. Louis, MO, United States)	P2443
Potassium chloride (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States	BP366-500
Pressure monitor system	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)	PM-4
Pressure Transducer	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)	PT-F
Silicone-lined petri-dish	custom-made in the lab
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States	BP328-500
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States	BP358-212
Sodium phosphate (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States	BP329-500
Sprague-Dawley rats	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Male	9-13 weeks old
Stereomicroscope	Leica Microsystems (Wetzlar, Germany)	S9D
Vannas spring scissors	Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)	15000-03