İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Özet

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Retina, görme yolunun ilk aşamasını oluşturan çeşitli nöronal devreler oluşturan çok sayıda hücreden oluşur. Her devre, rolünü ve işlevsel önemini belirleyen benzersiz özellikler ve farklı nörotransmiterler ile karakterize edilir. Yapısındaki karmaşık hücre tipleri göz önüne alındığında, retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı keşif için zorluklar doğurur. Koni ve çubuk yolları arasındaki bağlantı gibi retina devrelerini ve çapraz konuşmayı ve fare retinasında P benzeri immünoreaktivite maddesinin varlığı gibi kesin moleküler lokalizasyonu (nörotransmiterler veya nöropeptitler) daha iyi araştırmak için, sinaptik bağlantıları ve organizasyonu keşfetmek için önceden gömülü bir immünoelektron mikroskobu (immüno-EM) yöntemi kullandık. Bu yaklaşım, spesifik hücreler arası sinaptik bağlantıları ve kesin moleküler lokalizasyonu belirlememizi sağlar ve işlevini keşfetmede yol gösterici bir rol oynayabilir. Bu makale, (1) retina fiksasyon hazırlığı, (2) ön gömme immün boyama ve (3) sabitleme sonrası ve gömme dahil olmak üzere protokolü, kullanılan reaktifleri ve ayrıntılı adımları açıklamaktadır.

Giriş

Retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı, yapısındaki çeşitli hücre tipleri göz önüne alındığında, keşif için zorluklar ortaya çıkarmaktadır ^1,2. İlk adım, farklı hücreler arasındaki sinaptik bağlantıların tanımlanmasını ve spesifik nörotransmiterlerin veya nöropeptitlerin hücresel lokalizasyonunun belirlenmesini içerir. Moleküler biyolojideki ilerlemeler yeni proteinleri tanıttıkça, retinadaki hassas lokalizasyon, işlevlerini anlamak ve retina devrelerini ve sinaptik bağlantıları analiz etmek için çok önemli hale gelir ^3,4,5

Protokol

Hayvanların bakımı ve idaresi, ARVO yönergelerine uygun olarak Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Kurul Yönetmeliği tarafından onaylanmıştır. Bu araştırmada yetişkin fareler (C57BL / 6J, erkek ve dişi, 8 ila 12 haftalık) kullanılmıştır. Çalışma için gerekli ekipman ve reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Retina fiksasyonu için hazırlık

1. Aşağıdaki malzemeleri ve aletleri birleştirin: bir diseksiyon mikroskobu, çok ince uçlu iki forseps, makas, 1 mL şırınga iğnesi (iğne boyutu: G26) ve filtre kağıdı.
2. 0.25 mg / g vücut ağırlığında 2,2,2-tribromoetanol....

Tartışmalar

Bu makale, sinaptik devrelerin ve protein lokalizasyonunun başarılı bir şekilde gözlemlenmesi için üç kritik adımı tanımlamıştır: (1) hızlı ve zayıf fiksasyon, (2) ön gömme immün boyama ve (3) fiksasyon sonrası ve gömme.

Fiksasyonun, başarılı bir pre-embedding immüno-EM yaklaşımı için anahtar adım olduğunu öneriyoruz. Bu nedenle, burada taze fiksatif ve hızlı fiksasyonun önemi vurgulanmakta ve bu ilkeye doku hazırlığında.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001