Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Retina, görme yolunun ilk aşamasını oluşturan çeşitli nöronal devreler oluşturan çok sayıda hücreden oluşur. Her devre, rolünü ve işlevsel önemini belirleyen benzersiz özellikler ve farklı nörotransmiterler ile karakterize edilir. Yapısındaki karmaşık hücre tipleri göz önüne alındığında, retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı keşif için zorluklar doğurur. Koni ve çubuk yolları arasındaki bağlantı gibi retina devrelerini ve çapraz konuşmayı ve fare retinasında P benzeri immünoreaktivite maddesinin varlığı gibi kesin moleküler lokalizasyonu (nörotransmiterler veya nöropeptitler) daha iyi araştırmak için, sinaptik bağlantıları ve organizasyonu keşfetmek için önceden gömülü bir immünoelektron mikroskobu (immüno-EM) yöntemi kullandık. Bu yaklaşım, spesifik hücreler arası sinaptik bağlantıları ve kesin moleküler lokalizasyonu belirlememizi sağlar ve işlevini keşfetmede yol gösterici bir rol oynayabilir. Bu makale, (1) retina fiksasyon hazırlığı, (2) ön gömme immün boyama ve (3) sabitleme sonrası ve gömme dahil olmak üzere protokolü, kullanılan reaktifleri ve ayrıntılı adımları açıklamaktadır.

Giriş

Retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı, yapısındaki çeşitli hücre tipleri göz önüne alındığında, keşif için zorluklar ortaya çıkarmaktadır 1,2. İlk adım, farklı hücreler arasındaki sinaptik bağlantıların tanımlanmasını ve spesifik nörotransmiterlerin veya nöropeptitlerin hücresel lokalizasyonunun belirlenmesini içerir. Moleküler biyolojideki ilerlemeler yeni proteinleri tanıttıkça, retinadaki hassas lokalizasyon, işlevlerini anlamak ve retina devrelerini ve sinaptik bağlantıları analiz etmek için çok önemli hale gelir 3,4,5

Protokol

Hayvanların bakımı ve idaresi, ARVO yönergelerine uygun olarak Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Kurul Yönetmeliği tarafından onaylanmıştır. Bu araştırmada yetişkin fareler (C57BL / 6J, erkek ve dişi, 8 ila 12 haftalık) kullanılmıştır. Çalışma için gerekli ekipman ve reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Retina fiksasyonu için hazırlık

  1. Aşağıdaki malzemeleri ve aletleri birleştirin: bir diseksiyon mikroskobu, çok ince uçlu iki forseps, makas, 1 mL şırınga iğnesi (iğne boyutu: G26) ve filtre kağıdı.
  2. 0.25 mg / g vücut ağırlığında 2,2,2-tribromoetanol....

Temsili Sonuçlar

Şekil 1 , protein kinaz C alfa (PKCα) veya SP'ye karşı primer antikorların inkübasyonu olmadan, immünoreaktivite (IR) bulunmayan kontrol deneylerinin örneklerini göstermektedir.

Şekil 2 , fare retinasındaki PKCα-IR'yi göstermektedir. PKCα, retina18'deki tüm çubuk bipolar hücreler (RBC) için bir belirteç görevi görür. Elektron mikroskobu (EM) seviyesinde, R.......

Tartışmalar

Bu makale, sinaptik devrelerin ve protein lokalizasyonunun başarılı bir şekilde gözlemlenmesi için üç kritik adımı tanımlamıştır: (1) hızlı ve zayıf fiksasyon, (2) ön gömme immün boyama ve (3) fiksasyon sonrası ve gömme.

Fiksasyonun, başarılı bir pre-embedding immüno-EM yaklaşımı için anahtar adım olduğunu öneriyoruz. Bu nedenle, burada taze fiksatif ve hızlı fiksasyonun önemi vurgulanmakta ve bu ilkeye doku hazırlığında.......

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Nörobilim Anahtar Laboratuvarı (SKLN-202103), Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019) Hibeleri ile desteklenmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe needlekangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
8% ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
AcetoneElectron Microscopy Science10000
Anti-rabbit PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Rabbit SPAbcamab67006
DAB Substrate kitMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
Elbow scissorsSuzhou66 vision company54010
Electron microscopePhillipsCM120
Epon resinElectron Microscopy Science14910
forcepSuzhou66 vision companyS101A
Millipore filter paperMerck Millipore PR05538
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of phosphate buffer
Picric acidElectron Microscopy Science19550
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotomeLeica
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)Vector LaboratoriesPK-4001

Referanslar

  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuit....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.