Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

Özet

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Özet

Proteinler insan fizyolojisi için temeldir ve hedefleri araştırma ve ilaç geliştirmede çok önemlidir. Önemli protein hedeflerinin tanımlanması ve doğrulanması, ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Moleküler yerleştirme, özellikle ilaç ve protein hedef etkileşimleri bağlamında, protein-ligand bağlanmasını araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır. Bağlanmanın deneysel olarak doğrulanması ve ilacın ve hedefinin bağlanmasına doğrudan erişmek için hücresel termal kayma testi (CETSA) yöntemi kullanılır. Bu çalışma, ilaçlar ve hayati protein hedefleri arasındaki etkileşimleri tahmin etmek ve doğrulamak için moleküler yerleştirmeyi CETSA ile entegre etmeyi amaçladı. Spesifik olarak, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi ve moleküler yerleştirme analizi yoluyla bağlanma modunu tahmin ettik ve ardından CETSA tahlili kullanılarak etkileşimin doğrulanmasını izledik. Sonuçlarımız, ksantatinin Keap1 proteininin spesifik amino asit kalıntıları ile hidrojen bağları kurabildiğini ve Keap1 proteininin termostabilitesini azaltabildiğini gösterdi, bu da ksantatinin Keap1 proteini ile doğrudan etkileşime girebileceğini gösterdi.

Giriş

Proteinler, canlı organizmalarda son derece önemli makromoleküllerdir ve hücreler içinde zar bileşimi, hücre iskeleti oluşumu, enzim aktivitesi, taşıma, hücre sinyalizasyonu ve hem hücre içi hem de hücre dışı mekanizmalarda yer alma gibi çok çeşitli benzersiz işlevlere sahiptir ^1,2,3. Proteinler biyolojik işlevlerini esas olarak diğer proteinler, nükleik asitler, küçük moleküllü ligandlar ve^{metal iyonları 1,4} dahil olmak üzere çeşitli moleküllerle spesifik etkileşimler yoluyla gösterirler. Ligandlar, bir organizmadaki proteinlere spesifik olarak bağlanan küçük moleküler bileşiklerdir. Proteinler ve ligandlar arasındaki etkileşim, bağlanma cepleri⁵ olarak da bilinen bağlanma bölgeleri adı verilen protein üzerindeki belirli bölgelerde meydana gelir. Tıbbi kimya araştırmalarında odak noktası, ilaçlar için hedef olarak hizmet eden hastalıklarla açıkça ilişkili olan anahtar proteinlerin belirlenmesinde yatmaktadır⁶. Bu nedenle, proteinler ve ligandlar arasındaki bağlanma bölgelerinin derinlemesine anlaşılması, ilaç keşfi, tasarımı ve araştırmasının teşvik edilmesinde son derece önemlidir ^7,8.

Moleküler yerleştirme, kararlı kompleksler oluştururken birincil bağlanma modlarını ve afinitelerini keşfetmek için proteinlerin ve ligandların üç boyutlu yapılarını kullanan, protein-ligand bağlanmasını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır ^9,10,11. Moleküler yerleştirme teknolojisinin uygulanması 1970'lerde ortaya çıkmıştır. Kilit ve anahtar eşleştirme ilkesine dayalı olarak ve moleküler yerleştirme yazılımının algoritmalarını kullanarak, yerleştirme sonuçlarını analiz ederek bileşikler ve moleküler hedefler arasındaki etkileşim belirlenebilir. Bu yaklaşım, hem bileşik hem de hedef molekül için aktif bağlanma bölgelerinin tahmin edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu moleküler etkileşimlerin^mekaniğini anlamak için çok önemli olan ligand-reseptör etkileşimleri için optimal bir bağlanma konformasyonunun (burada bağlanma modeli olarak adlandırılır) tanımlanmasını kolaylaştırır 12,13,14,15. Moleküler yerleştirme, ligand-reseptör etkileşimlerinin değerli bilgisayar tabanlı tahminlerini sağlarken, bunların ön bulgular olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, bu etkileşimleri doğrulamak için daha fazla deneysel doğrulama şarttır.

İlk olarak 2013 yılında Pär Nordlund'un araştırma ekibi tarafından önerilen hücresel termal kayma testi (CETSA), ilaç-hedef protein etkileşimlerini doğrulamak için bir yöntem olarak hizmet eder. Bu teknik, ilaç bağlanması ile indüklenen hedef proteinlerin termal stabilitesini spesifik olarak test eder ve moleküler etkileşimleri doğrulamak için pratik bir yaklaşım sağlar 16,17,18. Bu yaklaşım, ligand bağlanmasının hedef proteinler içinde bir termal kayma başlattığı ve hücre lizatları, bozulmamış canlı hücreler ve dokular dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik numunelere uygulanabilir olduğu temel ilkesine dayanmaktadır^19,20. CETSA, ligand bağlanması nedeniyle proteinlerin termodinamik stabilizasyonunu tespit ederek ve gözlemlenen fenotipik yanıtı hedef bileşiğe^{bağlayarak bozulmamış} hücrelerde küçük moleküllerin doğrudan hedef etkileşimini destekler ^21,22. CETSA'dan türetilen çeşitli metodolojiler arasında, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) klasik bir yaklaşım olarak kabul edilir. CETSA yöntemi kullanılarak numune hazırlandıktan sonra, hedef proteinin termal stabilitesindeki değişiklikleri tespit etmek için western blot analizi kullanılır. Bu, hücresel sistemler içindeki ilaç-protein etkileşimlerinin kesin olarak belirlenmesine izin verir^17,23.

Ksantatin, geleneksel Çin tıbbında nazal sinüzit ve artrit gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılan anti-inflamatuar gibi özelliklere sahip Xanthium L. bitkisinden izole edilen biyoaktif bir bileşiktir^24,25. Kelch benzeri ECH ile ilişkili protein 1 (Keap1), Cullin3 bazlı Cullin-RING E3 ubikitin ligaz çok alt birimli protein kompleksinin bir bileşenidir ve hücre içi redoks durumunu modüle ederek inflamatuar yanıtın yoğunluğunu ve süresini etkileyen hücre içi redoks homeostazının önemli bir düzenleyicisidir²⁶. Bu çalışmada, ilk olarak, bağlanma modlarını tahmin etmeyi amaçlayan, ksantatin (küçük moleküllü) ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi araştırmak için moleküler yerleştirme kullandık. Daha sonra, ksantatinin Keap1 proteininin termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirerek bu etkileşimi doğrulamak için CETSA yöntemini kullandık.

Protokol

1. Xanthatin ve Keap1 yapılarının indirilmesi

1. PubChem veritabanını (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) açın, ksantatın (küçük molekül) girin, ardından Ara'ya basın ve İlk Sonuç'a tıklayın. Bileşiği .sdf formatında kaydetmek için İndir'e tıklayın ve 2B yapı altında Kaydet'e tıklayın.
2. Proteinin kristal yapısını indirin.
   1. UniProt veritabanını (https://www.uniprot.org/) açın, Keap1 girin ve Ara'ya tıklayın. Sol sütundaki popüler organizmalar altında İnsan'a tıklayın ve ardından sağ sütundaki Q14145 Adlı İlk Giriş'e tıklayın.
   2. Sol sütundaki fonksiyonun altındaki Yapı'ya tıklayın, PDB ID: 2FLU olan yapıyı bulun ve RCSB-PDB'ye tıklayın. Keap1 proteininin kristal yapısını indirmek için Dosyaları İndir'e tıklayın ve PDB Formatını seçin.

2. Moleküler yerleştirme

1. Masaüstünde molecular docking adında yeni bir klasör oluşturun ve indirilen ksantatin (küçük moleküllü) ve Keap1 (protein) yapılarını bu klasöre kaydedin.
   NOT: Klasör adı ve yolu İngilizce olmalıdır.
2. Maestro yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın, Çalışma Dizinini Değiştir'i seçin, Masaüstü'ne tıklayın, yeni oluşturulan moleküler yerleştirme klasörünü seçmek için çift tıklayın ve Seçenekleri Seç'e tıklayın.
3. Küçük molekül işleme
   1. Dosya ve yapı seçeneklerini içe aktar'a tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, xanthatin Yapı Dosyası'na tıklayın ve ardından küçük molekül dosyasını içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
   2. Yazılımın sağ üst köşesindeki Görevler'e tıklayın ve LigPrep seçeneğini seçin. Çalışma alanındaki yapıları kullanın; parametrelerin geri kalanı varsayılan parametrelerdir ve küçük molekül işlemeyi gerçekleştirmek için Çalıştır'a tıklayın.
4. Protein yapısı işleme
   1. File and Import Structures (Dosya ve Yapıları İçe Aktar) seçeneklerini tıklatın, Desktop'ı (Masaüstü) tıklatın ve Molecular Docking (Moleküler Yerleştirme) klasörüne çift tıklayın. Keap1 Protein Yapısı dosyasına tıklayın ve ardından protein yapısı dosyasını içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
   2. Yazılımın sağ üst köşesindeki Görevler'e tıklayın ve Protein Hazırlama Sihirbazı seçeneğini seçin. Het Gruplarından 5 Å'nin Üzerindeki Suları Silmeden Önce kutuyu işaretleyin ve 7.4 +/- 0.0 pH değerini girin. Ön İşlem'i tıklatın, İyileştir'i tıklatın ve sonra En İyileştir'i tıklatın > Suları Kaldır'ı > Küçült'ü tıklatın.
   3. Önceki görev tamamlandığında bir sonraki göreve tıklayın. Görevler'e tıklayın ve Site Haritası seçeneğini belirleyin, tüm parametreler için varsayılan ayarları kullan ve Çalıştır'a tıklayın.
   4. Dosya ve Yapıları İçe Aktar seçeneklerine tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın ve sitemap_1 adlı klasörü açın. Sitemap_1_out.maegz adlı ilk dosyaya tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
   5. Çalışma alanında sitemap_1_protein seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından seçmek için Sitemap_1_site_1 tıklayın. Görevler'e tıklayın ve Receptor Grid Generation (Alıcı Izgarası Oluşturma ) seçeneğini belirleyin.
      NOT: Site haritası tarafından tahmin edilen protein siteleri, en yüksek puan alan site ilk sırada olacak şekilde puanlamaya göre sıralanır.
   6. Alıcı altındaki Giriş seçeneğini seçin, kalan parametreler değişmeden kalır. Varsayılan boyutta bir yerleştirme kutusu oluşturmak için protein yapısındaki Küçük Beyaz Top'a tıklayın ve iş adını glide-grid_2FLU olarak değiştirin. Çalıştır'a tıklayın.
5. Moleküler yerleştirme
   1. Görevler'e tıklayın ve Ligand Yerleştirme seçeneğini seçin. Dosyadan Receptor Grid As (Alıcı Izgarası) seçeneğini seçin ve Browse (Gözat) düğmesini tıklatın. Masaüstü'ne tıklayın, moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, glide-grid_2FLU dosyasına çift tıklayın, Glide-grid_2FLU.zip dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
   2. Masaüstüne göz atmak > Dosyalardan Ligandları Kullan'> tıklayın. Moleküler yerleştirme klasörüne çift tıklayın, ligprep_1 dosyasına çift tıklayın, Ligprep_1-out.maegz dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
   3. Ayarlar'a tıklayın ve XP olarak Hassasiyet (ekstra hassasiyet) seçeneğini belirleyin, iş adını kayma-dock_XP_2FLU olarak değiştirin ve Çalıştır'a tıklayın.
6. Yerleştirme sonuçlarını görüntüleme
   1. File and Import Structures (Dosya ve Yapıları İçe Aktar) seçenekleri'ne tıklayın, Desktop'a tıklayın ve Molecular Docking klasörüne çift tıklayın. glide-dock_XP_2FLU dosyasına çift tıklayın, glide-dock_XP_1_pv.maegz dosyasına tıklayın ve ardından Aç'a tıklayın.
   2. Çalışma alanında ligand'ı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein'yi seçmek için tıklayın. Tablo'ya tıklayın, en sağa kaydırın ve yerleştirme puanı altında puanı görüntüleyin.
7. 2D sonuçların görselleştirilmesi
   1. Çalışma alanında ligandı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein seçmek için de tıklayın. Ligand Etkileşim > Görünümü'ne tıklayın ve LID gösterge kutusunu işaretleyin.
   2. Dosya'ya tıklayın, Ekran Görüntüsünü Kaydet'i seçin, genişliğe 6000 girin, Şeffaf Arka Plan kutusunun işaretini kaldırın ve Tamam'ı tıklayın. Masaüstüne tıklayın, dosyayı 2D-xanthatin-2FLU olarak adlandırın ve görüntüyü kaydedin.
8. 3D sonuçların görselleştirilmesi
   1. Çalışma alanında ligandı seçmek için noktaya çift tıklayın ve ardından sitemap_1_protein seçmek için de tıklayın.
   2. Küçük molekülleri seçmek için Hızlı Seçim'de L'yi tıklatın ve sonra Stil'i tıklatın. Küçük molekül bağının boyutunu değiştirmek için stildeki İkinci Satıra tıklayın ve küçük molekül rengini değiştirmek için renk atomlarına tıklayın.
   3. Şekildeki küçük molekülü seçin, farenin sağ tuşuna tıklayın, Seçimi Genişlet'i seçin ve 4 Å'yi seçin. Etiketleri görüntülemek için Etiketleri stil olarak uygula'yı tıklatın.
   4. Amino asit bağlarının boyutunu değiştirmek için stildeki ikinci satıra tıklayın ve amino asit rengini değiştirmek için Renk Atomlarına tıklayın.
   5. Sonraki > Ters Çevir'e tıklayın, kontrol tuşunu basılı tutun ve yalnızca etiketli amino asitleri göstermek için stil altındaki ilk göz konumuna tıklayın.
   6. Proteini şerit stili olarak göstermek için Kurdele Stili > 'a tıklayın ve kurdele rengini değiştirmek için kurdelelerin altındaki Kurdele Düzenle'ye tıklayın.
   7. Ekranın sağ alt köşesindeki Etkileşimler Geçişi'ne tıklayın, farenin sağ tuşuna tıklayın ve kişilerin/çakışmaların işaretini kaldırın.
   8. Görevlerde ölçü için arama yapın, Mesafe'yi seçin ve hidrojen bağlarının uzunluklarını ölçmek için ekrandaki sarı noktalı çizgi (hidrojen bağı) ile bağlanan iki atoma tıklayın.
   9. Proteini döndürmek, proteini ekranın ortasına ayarlamak ve her amino asit etiketinin görünür olduğundan emin olmak için farenin tekerleğini basılı tutun.
   10. Çalışma Alanı'na tıklayın > Resmi Farklı Kaydet'e tıklayın ve masaüstüne tıklayın. Görüntüyü varsayılan olarak 600dpi olarak kaydedin, dosyayı 3D-xanthatin-2FLU olarak adlandırın, dosya türünü tiff formatı olarak seçin ve görüntüyü kaydedin.

3. Hücre kültürü ve CETSA numune hazırlama

1. Hücre kültürü
   1. 100 mm'lik bir kültür kabına 5 x 10⁶ RAW264.7 hücre / mL ekleyin ve 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO_2'de% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti içeren 6 mL DMEM ortamı ile inkübe edin. Üç yemek hazırlayın ve hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında deneyi gerçekleştirin.
2. CETSA numune hazırlama
   1. Eski ortamı aspire edin, her yemeğe oda sıcaklığına ısıtılmış 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ekleyin ve 2 kez yıkayın.
   2. Her bir hücre kabına 2 mL PBS ekleyin, hücreleri karıştırın ve hücreleri iki adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 377 x g'da santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı atın ve hücreleri% 1 Geniş spektrumlu proteaz inhibitör karışımları içeren 2 mL PBS ile yeniden süspanse edin. Her birinde 1 mL hücre süspansiyonu bulunan ayrı mikrosantrifüj tüplerine bölün.
   4. Mikrosantrifüj tüplerini beyaz katı olana kadar sıvı nitrojen içinde dondurun, ardından hemen 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün ve 3 kez tekrarlayın. 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   5. Biri 100 μM ksantatin ve diğeri eşit hacimde DMSO içeren iki mikrosantrifüj tüpü alın ve her tüpe 450 μL santrifüjlenmiş süpernatan ekleyin, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   6. İki mikrosantrifüj tüpünden süpernatanı 60 μL / tüp hacminde 14 PCR tüpüne ekleyin ve tüpleri aynı anda değişen sıcaklıklarda (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C ve 63 °C) 3 dakika boyunca, DMSO ve ksantatin grupları için her sıcaklıkta iki PCR tüpü ile, sırasıyla.
   7. Isıtılmamış grup için, iki mikrosantrifüj tüpünün her birinden süpernatan alın ve her biri 60 μL'lik bir hacimde DMSO grubu için 7 ve ksantatin grubu için 7 olmak üzere 14 PCR tüpüne ekleyin. Numuneleri burada ısıtmayın.
   8. Isıtılmış grup için tüpleri oda sıcaklığında soğutun. Tüm tüpleri (ısıtılmış ve ısıtılmamış) 12.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve her tüpten 48 μL süpernatant yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın. Her tüpe 12 μL SDS-PAGE protein yükleme tamponu ekleyin, iyice karıştırmak için girdap yapın ve 100 ° C'de 5 dakika boyunca bir su banyosunda ısıtın.
      NOT: Hazırlanan CETSA numuneleri -80 °C'de saklanmalı ve 1 hafta içinde western blot ile test edilmelidir.

4. Batı lekesi

1. SDS-PAGE jelin hazırlanması
   1. Bir uzun ve bir kısa cam plakayı ultra saf suyla durulayın. Plakaları sıkıştırma yuvasına, ardından şeffaf bir tahtaya yerleştirin. Ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca sızıntı kontrolü yapın.
   2. Konik bir şişeye 8 mL düşük jel çözeltisi ve 8 mL düşük jel tamponu ekleyin ve hafifçe çalkalayarak karıştırın. Jel çözeltisine 160 μL pıhtılaştırıcı arttırıcı ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Alt yapışkan tabakasının hacmi, sıkıştırma yuvasındaki yeşil çizgiyi aşmamalıdır.
   3. Plakalardaki ultra saf suyu boşaltın ve filtre kağıdı ile kurulayın. Hazırlanan alt jel çözeltisini ekleyin. 2 mL izopropil alkol ekleyin ve katılaşma için 20 dakika bekleyin.
   4. 2 mL üst jel solüsyonu ve 2 mL üst jel tamponunu konik bir şişeye alın ve şişeyi hafifçe sallayarak karıştırın.
   5. İzopropil alkolü jel tabakasından çıkarın ve fazla izopropil alkolü filtre kağıdı ile kurulayın.
   6. Karışık üst jel solüsyonuna 40 μL pıhtılaştırıcı arttırıcı ekleyin, iyice karıştırın, ardından uzun ve kısa cam plakaların arasına ekleyin ve 1,5 mm 15 delikli bir tarak yerleştirin, 20 dakika bekleyin.
      NOT: Tarak, tarak ile çözelti arasında hava kabarcığı olmayacak şekilde üst katmana dik olarak yerleştirilmelidir.
2. Elektroforez
   1. Bir behere 1 L ultra saf su ekleyin, bir poşet SDS-PAGE çalışan tampon tozu ekleyin, bir cam çubukla iyice karıştırın ve hazırlanan jeli elektroforez ünitesine ekleyin. Üniteyi kutuya yerleştirin ve tarağı dışarı çekin.
   2. İşaretleyici ve CETSA örneklerini oda sıcaklığında, girdapta çözün ve aşağı döndürün. Önceden belirlenmiş sıraya göre ilk kuyucuğa 2,5 μL işaretleyici ve kalan kuyucukların her birine 20 μL CETSA numunesi ekleyin.
      NOT: CETSA numuneleri, adım 3.2.6'da 45 °C ila 63 °C arasında açıklanan sıcaklık işlemine göre art arda eklenmiştir; önce DMSO grubu, ardından ksantatın grubu eklendi (Şekil 1).
   3. Kalan elektroforez çözeltisini elektroforez ünitesine ekleyin, kapağı kapatın ve elektrodu, pozitif kutbu pozitif kutba, negatif kutbu negatif kutba yerleştirin.
   4. Güç anahtarını AÇIN ve elektroforezi başlatmak için voltaj anahtarını 80 V'a ayarlayın.
3. Membrana transfer
   1. Bir behere 850 mL ultra saf su, 100 mL susuz etanol ve 50 mL hızlı transfer tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Köpük levha, plastik bıçaklar, cımbız, tepsiler ve membran transfer cihazları hazırlayın.
   2. PVDF membranını jelin boyutuna göre kesin, işaretleyin ve etkinleştirmek için 30 saniye metanolde bekletin.
   3. Transfer solüsyonunu tepsiye dökün, transfer kelepçelerini yerleştirin ve açın ve bir sünger ped ve üç kat transfer filtre kağıdı yerleştirin.
   4. Elektroforezi durdurun ve ardından elektroforez kutusunun kapağını açın. Elektroforez cihazını alın, elektroforez solüsyonunu dökün ve plakayı çıkarın. Plakayı köpük levhanın üzerine yerleştirin, plastik bir bıçakla nazikçe kaldırın ve protein işaretleyicisini ve hedef proteinleri net bir şekilde görselleştirmek için jeli kesin.
   5. İşaretleyicinin bir tarafını cımbızla tutun, transmembran solüsyonu içeren bir tepside yıkayın ve filtre kağıdının üzerine düz bir şekilde koyun. Aktive edilmiş PVDF membranını transfer solüsyonuna batırın, etiketli tarafı cımbızla tutun ve jeli yüzü aşağı bakacak şekilde kapatın.
      NOT: PVDF membranın işaretli tarafı ön taraftır ve yerleştirme işlemi sırasında kabarcık oluşmamasına dikkat edin.
   6. PVDF membranının üzerine iki kat transfer filtre kağıdı ve bir kat sünger ped yerleştirin, transfer klipslerini kapatın ve sıkıştırın ve transfer tankına koyun.
      NOT: Aktarım klipsinin siyah rengi, aktarım yuvasının siyah rengine.
   7. Kalan transmembran çözeltisini transmembran kasete ekleyin, kapakla kapatın, pozitiften pozitife, negatiften negatife.
   8. Akımı 400 mA'ya, süreyi 30 dakikaya ayarlayın ve ardından membranı oda sıcaklığında aktarmaya başlamak için Çalıştır'a basın.
4. Engelleme
   1. Bir cam şişeye 2 L ultra saf su ekleyin, bir poşet TBS tozu ekleyin ve ardından TBST çözeltisi yapmak için 2 mL Tween ekleyin. TBST ile% 5'lik bir BSA çözeltisi hazırlamak için BSA tozunu tartın ve inkübasyon kutusuna 6 mL BSA çözeltisi ekleyin.
   2. Membran transferini durdurun ve ardından transfer klipsini açın. PVDF membranının işaretleyici tarafını sıkıştırın ve inkübasyon kutusuna yerleştirin. Kuluçka kutusunu bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 1,5 saat bloke edin.
5. Primer antikorun inkübasyonu
   1. Primer antikoru 1:1000'de% 5 BSA solüsyonu ile hazırlayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız), BSA solüsyonunu inkübatör kutusunda geri dönüştürün ve inkübasyon kutusuna 6 mL primer antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu buz paketleri olan bir köpük kutuya yerleştirin ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde tutun.
6. İkincil antikorun inkübasyonu
   1. Ertesi gün inkübasyon kutusunda birincil antikoru toplayın, ardından 6 mL TBST çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine koyun.
   2. Yıkanmış TBST çözeltisini dökün ve yıkamak için taze ekleyin; 5x'i tekrarlayın ve ikincil antikoru 1:5000'de% 5 BSA çözeltisi ile hazırlayın.
   3. TBST çözeltisini dökün ve inkübasyon kutusuna 6 mL ikincil antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin.
   4. İkincil antikoru toplayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın), ardından 6 mL TBST çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Yıkanmış TBST çözeltisini dökün ve yıkamak için taze ekleyin; 5x tekrarlayın.
7. Şeritlerin açığa çıkarılması
   1. TBST solüsyonunu son yıkamanın sonunda saklayın. Eşit hacimlerde kemilüminesan reaktifler A ve B alın, çalkalayın ve iyice karıştırın. Çözeltiyi ışıktan koruyun.
   2. Jel görüntüleme sistemini açın, Numuneler'e tıklayın, kalibrasyonu kontrol edin, kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin ve ardından İşaretleyici'ye tıklayın, kalibrasyonu kontrol edin.
   3. Şeridin işaretleyici tarafını cımbızla alın ve kemilüminesan reaktif çözeltisine tamamen daldırın. Şeridi görüntüleyiciye yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için işaretleyicinin bir tarafını sıkıştırın, görüntüleyicinin kapağını kapatın, Pozlama'ya tıklayın ve pozlama süresini 1 s'ye ayarlayın.
      NOT: Geliştirici şeridi tamamen kaplamalı ve geliştirme karanlık bir ortamda olmalıdır.
   4. Kaydet'i tıklatın, görüntüyü adlandırın ve .tif dosyası olarak kaydedin. Batı lekesinin optik yoğunluğunu analiz edin. DMSO grubundaki her bir sıcaklığın gri değerleri 45 °C'lik gri değerleri ile karşılaştırıldı ve ksantatin grubundaki her bir sıcaklığın gri değerleri, 45 °C'deki ksantatinin gri değerleri ile karşılaştırıldı.

Sonuçlar

Moleküler yerleştirme analizi, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi öngördü. Şekil 2 , Gly-367 için 2.17 şve Val-606 için 2.13 şhidrojen bağı uzunluğuna sahip Keap1 proteininin ksantatin ve amino asit kalıntıları Gly-367 ve Val-606 arasındaki hidrojen bağlarının oluşumunu göstermektedir. Ek olarak, -5.69 kcal/mol'lük hesaplanan yerleştirme skoru, ksantatin ve Keap1 proteini arasında iyi bir bağlanma afinitesini gösterir.

C...

Tartışmalar

Hastalık hedeflerinin belirlenmesi ve ilaçların keşfi ve geliştirilmesi birbiriyle yakından bağlantılıdır²⁷. Spesifik hedefleri tam olarak hedefleyerek, ilaçlarla ilişkili yan etkileri en aza indirirken aynı zamanda belirli hastalıkları daha etkili bir şekilde tedavi etmek için ilaç adayları geliştirilebilir^28,29. En sık kullanılan hedefler protein hedefleridir³⁰. Bununla birlikte, özel protei...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706