Vibrio Quorum Algılama İnhibitörlerinin Sentezi ve Testi

Özet

Tiyofensülfonamid bileşikleri, aktivitelerini in vivo olarak bloke eden ve böylece virülans, motilite ve biyofilmler için genlerin transkripsiyonunu önleyen Vibrio çekirdek algılama düzenleyicileri LuxR/HapR'nin güçlü ve spesifik inhibitörleridir. Bu protokol, bu bileşiklerin nasıl sentezlendiğini, in silico olarak nasıl modellendiğini ve LuxR/HapR'ye karşı aktivite için in vivo olarak nasıl test edildiğini detaylandırır.

Özet

Bakteriler, bakteri davranışlarını kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan bir hücre-hücre iletişim yöntemi olan çekirdek algılamayı kullanarak yerel popülasyon sayılarını tespit eder. Vibrio türlerinde, ana çekirdek algılama düzenleyicileri LuxR/HapR, birçoğu virülansı, metabolizmayı, hareketliliği ve daha fazlasını etkileyen yüzlerce çekirdek algılama genini kontrol eder. Tiyofensülfonamidler, bu transkripsiyon faktörlerinde ligand cebini bağlayan ve aşağı akış çekirdek algılama gen ekspresyonunu bloke eden güçlü LuxR/HapR inhibitörleridir. Bu bileşik sınıfı, üniversite öğrencilerinin kimya ve biyoloji becerilerini bir CURE modeli kullanarak özümsemeleri için bir dizi basit, sağlam ve eğitimsel prosedürün geliştirilmesinin temelini oluşturdu: ders tabanlı lisans araştırma deneyimi. Öğrencileri bir yıl süren CURE'ye dahil etmek için yinelemeli ve çok disiplinli bir platformda üç öğrenme aşamasından oluşan optimize edilmiş protokoller açıklanmaktadır: (1) tiyofensülfonamid çekirdeğine dayalı yeni küçük molekül inhibitörleri tasarlayın ve sentezleyin, (2) hedefe bağlanma afinitesini tahmin etmek için yapısal modellemeyi kullanın ve (3) bileşikleri spesifik Vibrio LuxR / HapR proteinlerine karşı mikrobiyolojik deneylerde etkinlik açısından test edin. E. coli'de gerçekleştirilen tarif edilen raportör testi, bileşiklerin doğal Vibrio türlerindeki hedef proteinlere karşı etkinliğini başarılı bir şekilde tahmin eder.

Giriş

Bakteriler, çekirdek algılama (QS)¹ adı verilen bir hücre-hücre iletişim sürecini kullanarak popülasyon yoğunluğunu ve yakındaki hücre türünü algılar. Çeşitli bakteri grupları, motilite, biyofilm oluşumu, virülans faktörü salgısı ve daha fazlası gibi çeşitli davranışları kontrol etmek için QS'yi kullanır. QS'de yer alan proteinler ve sinyaller bakteriler arasında büyük farklılıklar gösterir. Vibrio türlerinde, QS sinyal sistemi ağırlıklı olarak, otoindükleyiciler² olarak adlandırılan spesifik akraba küçük molekül sinyallerini tanıyan zara bağlı hibrit histidin-kinaz reseptörleri....

Protokol

Reaktiflerin ve çalışma için kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tiyofensülfonamid kütüphanelerinin tasarımı ve sentezi

NOT: 3-fenil-1- (tiyofen-2-ilsülfonil) -1 H-pirazol (PTSP) gibi tiyofensülfonamid inhibitörleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi tek aşamalı baz destekli yoğuşma ^8,9 yoluyla sentezlenir. Çalışma için yeni bileşik kütüphaneleri tasarlamak için, araştırmacılar uygun aminler ve sülfonil klorürler ....

Tartışmalar

Bu CURE başlangıçta kısaltılmış iki aşamalı, üç haftalık bir protokol (tasarım / sentez ve tahlil) olarak geliştirilmiştir ve üst düzey organik laboratuvar dersinin bir parçası olarak beş yarıyılda uygulanmıştır⁸. Orijinal rapordan bu yana, bilgisayar modelleme modülü eklendi ve E. coli testi acemi araştırmacılar için optimize edildi. Ortaya çıkan üç aşamalı, iki dönemlik protokol, Indiana Üniversitesi'nin Fen Edebiy.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract