Vibrio Quorum Algılama İnhibitörlerinin Sentezi ve Testi

Özet

Tiyofensülfonamid bileşikleri, aktivitelerini in vivo olarak bloke eden ve böylece virülans, motilite ve biyofilmler için genlerin transkripsiyonunu önleyen Vibrio çekirdek algılama düzenleyicileri LuxR/HapR'nin güçlü ve spesifik inhibitörleridir. Bu protokol, bu bileşiklerin nasıl sentezlendiğini, in silico olarak nasıl modellendiğini ve LuxR/HapR'ye karşı aktivite için in vivo olarak nasıl test edildiğini detaylandırır.

Özet

Bakteriler, bakteri davranışlarını kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan bir hücre-hücre iletişim yöntemi olan çekirdek algılamayı kullanarak yerel popülasyon sayılarını tespit eder. Vibrio türlerinde, ana çekirdek algılama düzenleyicileri LuxR/HapR, birçoğu virülansı, metabolizmayı, hareketliliği ve daha fazlasını etkileyen yüzlerce çekirdek algılama genini kontrol eder. Tiyofensülfonamidler, bu transkripsiyon faktörlerinde ligand cebini bağlayan ve aşağı akış çekirdek algılama gen ekspresyonunu bloke eden güçlü LuxR/HapR inhibitörleridir. Bu bileşik sınıfı, üniversite öğrencilerinin kimya ve biyoloji becerilerini bir CURE modeli kullanarak özümsemeleri için bir dizi basit, sağlam ve eğitimsel prosedürün geliştirilmesinin temelini oluşturdu: ders tabanlı lisans araştırma deneyimi. Öğrencileri bir yıl süren CURE'ye dahil etmek için yinelemeli ve çok disiplinli bir platformda üç öğrenme aşamasından oluşan optimize edilmiş protokoller açıklanmaktadır: (1) tiyofensülfonamid çekirdeğine dayalı yeni küçük molekül inhibitörleri tasarlayın ve sentezleyin, (2) hedefe bağlanma afinitesini tahmin etmek için yapısal modellemeyi kullanın ve (3) bileşikleri spesifik Vibrio LuxR / HapR proteinlerine karşı mikrobiyolojik deneylerde etkinlik açısından test edin. E. coli'de gerçekleştirilen tarif edilen raportör testi, bileşiklerin doğal Vibrio türlerindeki hedef proteinlere karşı etkinliğini başarılı bir şekilde tahmin eder.

Giriş

Bakteriler, çekirdek algılama (QS)¹ adı verilen bir hücre-hücre iletişim sürecini kullanarak popülasyon yoğunluğunu ve yakındaki hücre türünü algılar. Çeşitli bakteri grupları, motilite, biyofilm oluşumu, virülans faktörü salgısı ve daha fazlası gibi çeşitli davranışları kontrol etmek için QS'yi kullanır. QS'de yer alan proteinler ve sinyaller bakteriler arasında büyük farklılıklar gösterir. Vibrio türlerinde, QS sinyal sistemi ağırlıklı olarak, otoindükleyiciler² olarak adlandırılan spesifik akraba küçük molekül sinyallerini tanıyan zara bağlı hibrit histidin-kinaz reseptörlerini kullanır (Şekil 1). Bu reseptörler, fosfatın sistem boyunca küçük RNA'ları kopyalayan bir yanıt düzenleyicisine akışını kontrol eder. sRNA'ların üretimi, topluca LuxR/HapR³ olarak adlandırılan korunmuş bir protein grubu olarak tanımlanan ana çekirdek algılama düzenleyicisinin üretimini değiştirir. Bu nedenle, düşük hücre yoğunluklarında, LuxR/HapR'yi kodlayan mRNA, sRNA hedeflemesi yoluyla bozunur ve yüksek hücre yoğunluğunda, LuxR/HapR proteini maksimum seviyelerde üretilir (Ball ve ^ark.3'te gözden geçirilmiştir).

LuxR/HapR protein grubu, DNA bağlanma alanında bir sarmal-dönüş-sarmalın varlığı, fonksiyonel bir homodimerin oluşumu ve tipik olarak bir ligand bağlanma alanının^{dahil edilmesi ile} tanımlanan büyük TetR proteinleri grubuna aittir 4. Vibrio LuxR / HapR proteinleri tüm bu kriterlere uymaktadır, ancak bir ligand henüz tanımlanmamıştır. İncelenen tüm Vibrio türlerindeki LuxR / HapR proteini, birçoğunun patogenezde önemli olduğu bilinen çok sayıda aşağı akış davranışını kontrol eder: biyofilmlerin, proteazların, sitotoksinlerin, hemolizinlerin, tip III sekresyonun ve tip VI sekresyon komplekslerinin üretimi ve daha fazlası³. LuxR/HapR proteininin silinmesi, konakçı sistemlerde virülansın azalmasına veya kaybına yol açar ^5,6,7, ^bu da bu proteinlerin inhibisyonunun hastalığın ilerlemesine karşı koymak için uygun bir strateji olduğu hipotezine yol açar. Vibrio türleri, balıklar, kabuklu deniz ürünleri ve mercanlar dahil olmak üzere deniz organizmalarında ve ayrıca belirli türlerle temas eden veya yutan insanlarda vibriosis hastalığına neden olur.

Önceki araştırmalar, işlevlerini ^5,8,9 bloke etmek için birden fazla Vibrio türünde LuxR/HapR proteinlerinin ligand bağlanma alanına spesifik olarak bağlanan bir tiyofensülfonamid bileşikleri paneli tanımlamıştır (Şekil 1). E. coli'de bir raportör ekran kullanılarak, bileşikler tanımlandı ve daha sonra heterolog E. coli'deki etki ile Vibrio^9'daki etkinlik arasında yüksek bir korelasyon gösteren doğal Vibrio'da test edildi. Bu bileşiklerin tek bir adımda sentezlenmesi kolaydır, bu da onları bir kimyasal biyoloji laboratuvarı dersi bağlamında küçük kütüphane sentezi için ideal hale getirir. Bu moleküler iskele etrafında tasarlanan üç haftalık kursa dayalı bir lisans araştırma deneyimi (CURE) daha önce bildirilmiştir⁸. Bu üç haftalık modül, çeşitli Vibrio türlerinde LuxR / HapR proteinlerinin inhibisyonunu hedeflemek için tasarlanan bu bir yıllık CURE'de daha da optimize edildi, kolaylaştırıldı ve genişletildi.

Protokol

Reaktiflerin ve çalışma için kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tiyofensülfonamid kütüphanelerinin tasarımı ve sentezi

NOT: 3-fenil-1- (tiyofen-2-ilsülfonil) -1 H-pirazol (PTSP) gibi tiyofensülfonamid inhibitörleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi tek aşamalı baz destekli yoğuşma ^8,9 yoluyla sentezlenir. Çalışma için yeni bileşik kütüphaneleri tasarlamak için, araştırmacılar uygun aminler ve sülfonil klorürler tedarik etmeli ve aşağıda özetlenen adımları izlemelidir. Amin'in yapısı aromatik pirazol türevinden büyük ölçüde farklıysa, literatürde araştırma yapılarak alternatif reaksiyon koşullarının tanımlanması gerekebilir. Bu prosedür sağlamdır ve sodyum hidroksit, trietil amin ve piridin gibi bazlar da iyi çalışmıştır. Bu bir kursta gerçekleştirilirse, öğrencilere muhtemelen olumlu sonuçları olan kendi prosedürlerini seçme özgürlüğü verilebilir.

1. PTSP'nin sentezi ve izolasyonu
   NOT: Bu, 3 saatlik bir laboratuvar periyodunda tamamlanabilir.
   1. 822 mg fenilpirazolün (5.7 mmol amin, 1.5 denk) 15 mL tetrahidrofuran içinde 50 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişede bir karıştırma çubuğu ile çözün.
   2. Bir süspansiyon oluşturmak için yavaşça 306 mg sodyum hidrit (yağda %60, 7.65 mmol, 2 denk.) ekleyin. Bu süspansiyonun bir karıştırma plakası üzerinde 10 dakika karıştırılmasına izin verin.
   3. Bir şişede, 5 mL THF içinde bir tiyofensülfonil klorür çözeltisi (3.82 mmol sülfonil klorür, 1 denk.) hazırlayın.
   4. Adım 1.1.3'te hazırlanan sülfonil klorür çözeltisini adım 1.1.2'de hazırlanan süspansiyona ekleyin ve elde edilen süspansiyonun 30 dakika daha karışmasına izin verin.
   5. 50 mL yuvarlak tabanlı şişedeki reaksiyon karışımına 20 mL DI su ekleyin.
   6. Karıştırma çubuğu dışındaki reaksiyon şişesinin tüm içeriğini 250 mL'lik bir ayırma hunisine¹⁰ aktarın.
   7. Ayırma hunisine 20 mL etil asetat (EtOAc) ekleyin ve çalkalayın.
   8. Alt (sulu) tabakayı çıkarın ve bir kenara koyun.
   9. Üst (organik) katmanı çıkarın ve 200 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine koyun.
   10. Sulu tabakayı ayırma hunisine geri koyun ve 20 mL etil asetat ile ekstrakte edin.
   11. 1.1.8 ve 1.1.9 adımlarını tekrarlayın.
   12. Birleştirilmiş organik katmanları ayırma hunisine geri koyun ve 20 mL doymuş NaCl (tuzlu su) ile yıkayın.
   13. Alt (sulu) tabakayı çıkarın ve bir kenara koyun.
   14. Üst (organik) katmanı tekrar Erlenmeyer şişesine boşaltın.
   15. Birleştirilmiş organik katmanları Erlenmeyer_şişesinde MgSO4 üzerinde kurutun ve kalitatif filtre kağıdı^{250 kullanarak 10} mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye süzün.
   16. Döner bir buharlaştırıcı üzerindeki organik çözücüyü çıkarın.
2. Ürünün ¹⁰oluşturduğundan emin olmak için ham reaksiyon karışımını¹ H NMR ile analiz edin.
   NOT: Bu adım için gereken süre, öğrencinin NMR spektroskopisi ile konfor seviyesine bağlı olacaktır.
3. Ürünü silika jel kolon kromatografisi (10:1 heksan: etil asetat)¹⁰ ile saflaştırın.
   NOT: Bu, 3 saatlik bir laboratuvar periyodunda tamamlanabilir.
4. Ürünü spektroskopik olarak karakterize edin.
   NOT: Bu adım için gereken süre, öğrencinin NMR spektroskopisi ile konfor seviyesine bağlı olacaktır.
   NOT: 3-fenil-1- (tiyofen-2-ilsülfonil) -1 H-pirazol (PTSP) ¹⁰ için karakterizasyon verileri:
   ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ 8.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.88 - 7.79 (m, 3H), 7.68 (dd, J = 5.0, 1.4 Hz, 1H), 7.44 - 7.31 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 5.0, 3.9 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
   ¹³C NMR (101 MHz, CDCl ₃): δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
   İKYS (ESI): C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M + Na ⁺] için hesaplanmıştır: 313.0076. Bulunan: 313.0078.

2. Tiyofensülfonamidlerin Vibrio LuxR / HapR regülatörüne bağlanmasını tahmin etmek için yapısal modelleme

NOT: Bu protokol, küçük moleküllü inhibitörleri (bu durumda PTSP) Vibrio vulnificus^12'den SmcR adı verilen LuxR/HapR homologunun ligand bağlama cebine yerleştirmek için AutoDock Vina'nın Webina¹¹ adlı web tabanlı sürümünü kullanır. Bu protokolün sonuçları, (1) hesaplanan bağlanma afiniteleri ve (2) ligand-protein etkileşimlerini görselleştirmek için PyMol'de veya ilgili bir programda açılabilen bir yapı dosyasıdır. Bu protokol, herhangi bir küçük molekül ve ligand bağlama cebi olan herhangi bir protein için uyarlanabilir. Bu reseptörün arama alanı aşağıda tanımlandığı için SmcR'ye kenetlenmesi dakikalar alır. Yeni bir reseptör için arama alanının tanımlanması gerekiyorsa (adım 2.15-2.20), bu 3 saatlik bir laboratuvar periyodunda tamamlanabilir. Arama alanı tanımlandıktan sonra, sonraki yerleştirme işlemleri birkaç dakika sürecektir.

1. AutoDock Araçları'nı indirin. İşletim sistemi için uygun dosyayı seçin ve bilgisayara yükleyin.
   NOT: Bu protokol, AutoDock Vina'nın web tabanlı bir sürümünü kullanır. Bu program yüklüyse yerleştirme yerel olarak da gerçekleştirilebilir (üreticinin talimatlarına bakın).
2. apo SmcR için yapıyı indirin.
3. Protein Veri Bankası'na gidin.
4. Arama çubuğuna PDB ID 3KZ9'u girin.
5. Sayfanın sağ üst köşesine doğru açılan menüden Dosyaları İndir'e tıklayın ve pdb biçimini seçin.
6. Dosyayı indirdikten sonra, yerleştirme işine ayrılmış yeni bir klasöre kaydedin .
7. Küçük molekül inhibitörünün (PTSP) bir .mol yapı dosyasını oluşturun.
8. Molview'e gidin ve oradaki yapıyı kaldırmak için çöp kutusu simgesine tıklayın.
9. Yapı penceresinde PTSP'yi çizin.
10. 2D'den 3D'ye tıklayın.
11. MOL dosyasını dışa aktarmak → Araçlar→a tıklayın.
12. Bilgisayara "Molview.mol" başlıklı bir dosya indirilecektir. Dosyaya anlamlı bir ad verin ve protein pdb dosyasını içeren klasöre kaydedin .
13. Arama alanını tanımlayın.
14. Doğru bölgeye kenetlenmeyi kolaylaştırmak için Webina'daki alanı proteinin (SmcR) bağlanma cebi olarak tanımlayın.
    NOT: SmcR koordinatları aşağıdaki protokol kullanılarak sağlanır ve oluşturulur. SmcR kullanılıyorsa, 2.15-2.20 adımları atlanabilir. Protokol, bilinen bir ligand bağlama cebine sahip herhangi bir protein için uyarlanabilir. Koordinatlar: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. AutoDock Tools'da, Dosya → Molekülü Oku'ya tıklayın ve adım 2.5'te indirilen pdb protein dosyasını açın.
16. Kontrol paneline gidin ve proteinin adının yanındaki mavi oka tıklayın. Bu, zincirlerin bir listesini getirecektir. Protein zincirlerinden birinin yanındaki mavi oka tıklayın.
17. Bağlanma cebinin amino asitlerini vurgulamak için, ortaya çıkan listede ilgilenilen amino asidi bulun. Amino asidin yanında, en sağdaki Cl (renk) sütunundaki üçgene gidin. Üçgene tıklayın ve gökkuşağına göre seçin.
    NOT: Aşağıdaki amino asitleri vurgulamak için bu yöntemi kullanın: ¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (Met100 eksikse, bu atlanabilir).
18. Ardından, Grid → GridBox'a tıklayın. Protein yapısının üzerinde kırmızı, yeşil ve mavi yüzlü bir kutu görünmelidir. Herhangi bir değişiklik yapmadan önce Aralık (angstrom) değerini 1 olarak değiştirin. Bu, kutunun sonraki adımlar için doğru şekilde ölçeklendirilmesini sağlayacaktır.
    1. Ardından, kutuyu vurgulanan amino asitlerin üzerine yerleştirmek üzere x, y ve z yönlerine çevirmek için Merkez Izgara Kutusu kadranlarını değiştirin. Yapıyı üç boyutlu olarak döndürmek için proteini tıklayın ve sürükleyin.
       NOT: Bu, kutunun doğru konumda olduğundan emin olmanıza yardımcı olacaktır. Gerekirse, kutunun boyutunu değiştirmek için nokta sayısı için üstteki üç kadranı kullanın.
19. Kutu konumu ve boyutları ayarlandıktan sonra, Dosya'ya tıklayın → Tasarruf Akımını Kapatın.
20. Menüde, GPF→yi Kaydet → Izgara Çıktısı'na tıklayın. Dosyayı adlandırın ve iki yapı dosyasıyla aynı klasöre kaydedin. Bu GPF dosyası kutu koordinatlarına sahiptir.
21. Hesaplanmış bir bağlanma enerjisi üretmek için Webina'da "Yerleştirme" gerçekleştirin.
22. .mol ligand dosyasını ve .pdb protein dosyasını içeren klasörü açın. Webina, .pdbqt dosyaları gerektirir ve dosya dönüştürmeyi yapar.
23. Webina'ya gidin.
24. Reseptör: 3kz9.pdb adlı pdb'den indirilen dosyanın üzerine sürükleyin. Hidrojen atomları ekle'ye tıklayın ve dönüştür'e tıklayın. Bir monomer ile çalışmak için bir sonraki açılır pencerede Tamam'a tıklayın.
25. Ligand: PTSP (veya başka bir küçük molekül inhibitörü) için .mol dosyasının üzerine sürükleyin. Hiçbir kutunun seçili olmadığından emin olun ve Dönüştür'e tıklayın. "Doğru Poz"u boş bırakın ve Bağlantı Kutusu'na ilerleyin. Uygun kutu parametrelerini girin (SmcR için yukarıda listelenenler veya farklı bir protein için 2.15-2.20 adımlarında protokol tarafından oluşturulan bir set).
26. Webina'yı Başlat'a tıklayın ve bekleyin.
27. Bir dizi hesaplanmış bağlanma enerjisi, kenetlenmiş molekülün görselleştirilmesinin hemen altında [Afinite (kcal/mol)] rapor edilecektir. İlk değerin en negatif değer olduğundan emin olun.
28. Yerleştirilmiş ligandı pymol veya benzeri bir programda görselleştirmek için, uygun indirme düğmesine tıklayarak Çıkış PDBQT Dosyasını indirin. Bu dosya, yalnızca yerleştirilmiş koordinatlardaki liganddır (PTSP).
29. PyMol^13'te kenetlenmiş ligand-SmcR kompleksini görselleştirin.
    1. PyMol'ü indirin ve açın.
       NOT: Tam zamanlı öğrenciler ve eğitimciler ücretsiz olarak PyMol Lisansı alabilirler. PyMol'u ilk kez başlattıktan sonra lisans istendiğinde, Lisans Satın Al'a tıklayın. Öğrenci/Öğretmen'i seçin.
    2. 3kz9.pdb adlı pdb dosyasını açın.
    3. Webina tarafından oluşturulan pdbqt çıktı dosyasını açın.
    4. PyMol ekranının sağ alt köşesindeki küçük işaret eden oklara tıklayarak en iyi konformasyonu (en düşük bağlanma afinitesine sahip olanı) görselleştirin. İlk konfigürasyon en uygun olacak ve dosya açıldığında gösterilecektir.
    5. Standart komutları¹⁴ kullanarak proteini PyMol'e yerleştirilmiş ligand ile manipüle edin.
       NOT: Newman ve ark. tarafından yapılan önceki çalışma, Webina tarafından belirlenen çeşitli bileşiklerin tahmin edilen bağlanma afinitelerini in vitro ve in vivo deneylerle^{karşılaştırdı 9}. Bu bağlanma afiniteleri, bağlanma cebi için yüksek afiniteye (daha düşük kcal/mol sayılarıyla ilişkili) sahip iyi inhibitörler olması muhtemel bileşikler için referans görevi görür. Webina çıktı verilerinin bir örneği, SmcR'nin cebindeki PTSP bağlanması için Şekil 3A,B'de yer almaktadır.

3. Çekirdek algılama inhibisyonunda tiyofensülfonamidlerin biyolojik değerlendirmesi

NOT: Vibrio campbellii proteini LuxR'nin tahlili için özel prosedür burada açıklanmaktadır. Bununla birlikte, bu prosedür, tümü raportör plazmid pJV064⁹ ile uyumlu ektopik olarak çoğalan plazmitlerde bulunan Vibrio LuxR / HapR proteinlerinden herhangi biri ile kullanım için uyarlanabilir. "Kırmızı-yeşil ekran" testi, iki plazmidi içeren E. coli hücreleri kullanılarak heterolog bir bakteri arka planında gerçekleştirilir. Farklı LuxR genlerini ifade eden LuxR/HapR ekspresyonu plazmidi (kanamisin direnci sağlar) mevcuttur (Şekil 4A). pJV064 plazmidi (kloramfenikol direnci veren), LuxR ile aktive edilen bir promotörün kontrolü altında bir gfp genini ve LuxR ile bastırılmış bir promotörün kontrolü altında bir mCherry genini kodlar (Şekil 4A). Her iki promotör de, in vivo¹⁵ ekspresyonunda büyük değişiklikler olan LuxR tarafından düzenlenen genler olarak tanımlanmaları nedeniyle seçildi. LuxR/HapR E. coli suşları ve plazmid pJV064 daha önce yayınlanmıştır ^9,15.

1. Sıvı ortam hazırlama: 1 L LB ortamı hazırlayın.
   1. 10 g NaCl, 10 g baktotripton ve 5 g maya özütü tartın.
   2. Bileşenleri bir karıştırma plakası kullanarak bir beher veya dereceli silindirde karıştırın.
   3. Dereceli silindirler kullanarak toplam hacmi 1 L'ye getirin.
   4. İstenirse, otoklavlamadan önce şişe başına 100 mL'ye alikotlayın.
   5. Her 1 L ortam için 15 dakika otoklavlayın. Alternatif olarak, bir otoklav mevcut değilse, bir Instant Pot^{kullanılabilir 16}.
2. Suş aşılaması (1. Gün)
   1. Kanamisin (40 μg/mL) ve kloramfenikol (10 μg/mL) son konsantrasyonlarında LB ortamına antibiyotik ekleyin.
   2. 5 mL LB / Kan40 / CM10 ortamını kapaklı steril test tüplerine alikot edin.
   3. Dondurucu stoklarından E. coli suşlarını aşılayın: LuxR/HapR ve pJV064 plazmidini (LuxR+⁾ eksprese eden E. coli ^{kültürü9,15}; E. coli boş vektör kontrol kültürü ve pJV064 plazmid (LuxR-)^9,15.
   4. Kültürü gece boyunca 275 rpm'de 30 ° C'de 16-18 saat çalkalayın.
3. Tiyofensülfonamidlerin tahlili (2. Gün)
   1. Bileşiğin ~ 30 mg'ını tartın. DMSO'da 100 mM'ye yeniden askıya alın ve karıştırmak için girdaplayın. Ardından, 10 mM'lik bir stok hazırlayın.
   2. 10 mM'lik bir çalışma stoğu elde etmek için seyreltmek için (1:10) 10 μL'lik 100 μL'lik stoğun 20 μL'sini 180 μL DMSO ile karıştırın. Karıştırmak için girdap.
   3. LuxR + kültürünü ve LuxR kültürlerini (1:100) 10 mL LB / Kan / CM ortamında 15 mL konik tüplere geri seyreltin ve karıştırmak için kısaca girdaplayın.
   4. Tahlil için siyah kuyulu, açık tabanlı, steril 96 oyuklu bir plaka kullanın.
   5. Tüm sütunlar için bir seyreltme serisi hazırlayın. 4 katlı seyreltme serisinin bir diyagramı referans olarak dahil edilmiştir (Şekil 4B).
      NOT: Bu işlem için dijital çok kanallı bir pipet önerilir. Bu yöntem, 4 katlı seyreltme serisi (1:4) içindir. Bununla birlikte, farklı seyreltme serileri kullanılabilir (örneğin, 1:10, 1:5).
      1. 200 μL LuxR+ kültür karışımını A, 1-6 satırındaki 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin (Şekil 4B; yeşil).
      2. 200 μL LuxR-kültür karışımını A, 7-12 satırındaki 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin (Şekil 4B; turuncu).
      3. 150 μL LuxR+ kültür karışımını B-E, 1-6 satırları halinde 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin (Şekil 4B; yeşil).
      4. 150 μL LuxR-kültür karışımını B-E, 7-12 sıraları halinde 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin (Şekil 4B; turuncu).
      5. Şekil 2B'ye göre A sırasının her bir oyuğuna 4 μL bileşik veya DMSO ekleyin.
      6. Her sütun için 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından 50 μL'yi A satırından aynı sütundaki B satırına aktarın.
      7. B, C, D, E sıraları için karıştırma ve pipetleme işlemini tekrarlayın. E sırasını karıştırdıktan sonra 50 μL'yi çıkarın ve atıkları koyun. Sonunda, her kuyucukta 150 μL olmalıdır.
   6. Plakayı mikro gözenekli bantla örtün.
   7. Plakayı gece boyunca 30 °C'de 275 rpm'de 16-18 saat çalkalayarak inkübe edin.
   8. Tahlil plakalarının floresansını ve optik yoğunluğunu ölçün (3. Gün).
      1. Bandı dikkatlice çıkarın ve kuyucuklardan sıvı dökmeyin.
      2. Bir plaka okuyucuda, 600 nm (OD₆₀₀), GFP ve mCherry'deki optik yoğunluğu okuyun.
         NOT: Tahliller arasında karşılaştırmaları mümkün kılmak için her iki floresan kanalı için ayarlanmış bir kazanç önerilir.
   9. Verileri hücre başına normalleştirilmiş floresan olarak kaydedin: GFP/OD₆₀₀ ve mCherry/OD₆₀₀.
   10. Test numunelerine kıyasla DMSO kontrolünün sonuçlarını göstermek için verileri Şekil 5'te gösterildiği gibi çizin.

4. Siyah tahlil plakalarının yeniden kullanım için yıkanması

1. Plakaları çamaşır suyuna batırın.
   1. 1 L'lik plastik kabı "biyolojik atık" olarak etiketleyin. Plakalardaki sıvıyı bu atık kabına boşaltın (damlamaları %70 EtOH ile dikkatlice temizleyin). Plakaları fışkırtma şişesindeki DI su ile atığın üzerine durulayın ve içine boşaltın.
   2. Başka bir 1 L plastik kabı "%30 çamaşır suyu" olarak etiketleyin. Tabakları/kapakları bu kaba koyun ve üzerini %30 çamaşır suyu ile kapatın. Üstünü plastik bir örtü ile sarın ve plakaları bir uç kutusu veya benzeri bir şeyle tartın. Gece boyunca çamaşır suyu çözeltisine batırılmış halde bekletin.
2. Durulayın ve etanole batırın.
   1. Ağartıcı kalmaması için plakaları DI su ile lavaboya iyice durulayın. Kuyulardan kalan suyu lavaboya boşaltın.
   2. Bir sprey şişesi kullanarak tüm kuyucuklara ve kapaklara% 70 EtOH ekleyin. Plakaların kapak üstte olacak şekilde dik oturmasına izin verin, ancak EtOH'nin buharlaşabilmesi için eğik durun, ancak kuyucuklara hiçbir şey düşmez. Plakayı gece boyunca bekletin.
3. Plakaların kurumasını bekleyin.
   1. Kalan EtOH'yi boşaltın.
   2. Plakayı bir kağıt havluya ters çevirin ve EtOH'nin geri kalanının buharlaşmasına izin verin. Plakaları bu şekilde bir çeker ocakta bırakın. Plakalar bir sonraki kullanım için hazır olacaktır.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar olarak, lisans öğrencileri tarafından 1A, 2B ve 3B bileşikleri için sentezlenen üç tiyofensülfonamid bileşiğinden veriler dahil edilmiştir (Şekil 5A-C; Newman ve ark.⁹). Her bileşik, V. campbellii LuxR'yi eksprese eden ve pJV064 raportör plazmidi kullanılarak E. coli suşunda test edildi. Her test için hücre başına normalleştirilmiş flo...

Tartışmalar

Bu CURE başlangıçta kısaltılmış iki aşamalı, üç haftalık bir protokol (tasarım / sentez ve tahlil) olarak geliştirilmiştir ve üst düzey organik laboratuvar dersinin bir parçası olarak beş yarıyılda uygulanmıştır⁸. Orijinal rapordan bu yana, bilgisayar modelleme modülü eklendi ve E. coli testi acemi araştırmacılar için optimize edildi. Ortaya çıkan üç aşamalı, iki dönemlik protokol, Indiana Üniversitesi'nin Fen Edebiy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract