Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Özet

Farelere farklı zaman noktalarında iki floresan boya uygulanarak kan-beyin bariyeri (BBB) bozulmasına bağlı boya ekstravazasyonunu görselleştirmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Gliserolün kriyoprotektan olarak kullanılması, aynı numune üzerinde immünohistokimyayı kolaylaştırdı.

Özet

Floresan boyalar, kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması nedeniyle meydana gelen boya ekstravazasyonunun derecesini belirlemek için kullanılır. Bu boyalarla etiketleme, kandaki boya konsantrasyonu, beyin damarlarının geçirgenliği, boya ekstravazasyon süresi ve bozunma ve difüzyon nedeniyle dokudaki boya konsantrasyonunun azalması gibi çeşitli faktörlerden etkilenen karmaşık bir işlemdir. Hafif travmatik beyin hasarı modelinde, patlamaya bağlı şok dalgalarına (BSW'ler) maruz kalma, sınırlı bir zaman penceresi içinde BBB bozulmasını tetikler. BBB parçalanmasının kesin sırasını belirlemek için, Evans mavisi ve floresein izotiyosiyanat-dekstran, BSW maruziyetine göre çeşitli zaman noktalarında farelere intravasküler ve intrakardiyal olarak enjekte edildi. Boya floresansının beyin dilimlerindeki dağılımı daha sonra kaydedildi. İki boya arasındaki dağılım ve yoğunluktaki farklılıklar, BBB parçalanmasının uzay-zamansal sırasını ortaya çıkardı. Beyin dilimlerinin immün boyanması, astrositik ve mikroglial yanıtların BBB yıkım bölgeleri ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bu protokol, farklı BBB arıza modellerini içeren çalışmalarda uygulama için geniş bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması ve işlev bozukluğuna sistemik inflamasyon, enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar, yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar neden olur¹. Patlamaya bağlı şok dalgalarına (BSW'ler) maruz kalmaktan kaynaklanan hafif travmatik beyin hasarında (mTBI), BSW'lerin yoğunluğu ile BBB parçalanmasına bağlı floresan boya sızıntısı miktarı arasında önemli bir korelasyon gözlenmiştir ^2,3,4. mTBI'da BBB parçalanmasının dikkate değer bir özelliği, BSW'lere maruz kaldıktan hemen sonra veya birkaç saat içinde başlaması ve genellikle gecikmiş, kronik nörolojik bozuklukların ortaya çıkmasından önce yaklaşık bir hafta süren geçici bir süreç olmasıdır ^3,5,6,7. Ayrıntılar belirsizliğini korusa da, BBB dökümü uzun süreli patolojik kaskadının bir parçasıdır ve ayrıca mTBI^6'da prognostik bir faktör olarak hizmet edebilir. Bu nedenle, beyindeki BBB bozulmasının uzamsal ve zamansal dağılımlarını anlamak önemlidir.

Floresan boyalar, BBB parçalanmasının derecesini belirlemek için kullanılır ^3,8. Boyaların kan konsantrasyonu ve BBB parçalanmasının büyüklüğü ve kapsamı zamanla değiştiğinden, boya ekstravazasyonunun görüntülerini yorumlarken dikkatli olunmalıdır. Örneğin, boya ekstravazasyonunun olmaması, mutlaka BBB parçalanmasının olmadığını göstermez. Boyanın kan konsantrasyonundaki bir artıştan önce veya sonra BBB parçalanması tespit edilemez. Boya, BBB arızasının meydana geldiği yerde başarılı bir şekilde birikmiş olsa bile, arıza durduktan sonra zamanla kaybolmuş olabilir. Genel olarak, suda çözünür ve biyolojik olarak inert maddeler idrarla^{hızla atılır 9}. Bu nedenle, BBB parçalanmasının belirli bir zamanda meydana gelip gelmediğini belirlemek için, en güvenilir sonuçlar, hayvanı sabitlemeden hemen önce kısa bir süre için kan dolaşımına bir floresan boya uygulandığında elde edilir. Belirli bir moleküler ağırlığa sahip ticari olarak temin edilebilen floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran bu şekilde kullanılmalıdır.

Evans mavisi, serum albümini için güçlü bir afiniteye sahip, yaygın olarak tanınan bir mavi azo boyadır. Boya, biyolojik sistemlerde yeşil ışıkla uyarıldığında kırmızı floresan sergiler². İnert doğası nedeniyle, Evans mavi-serum albümin kompleksi kanda 2 saate kadar kalır, bu da onu en azından bu süre boyunca tehlikeye atılmış bir BBB'ye sahip bölgeleri etiketlemek için yararlı bir 69 kDa izleyici yapar^10,11. Bu nedenle, Evans blue^9'un farmakokinetiği ve toksisitesini çevreleyen potansiyel belirsizlikleri dikkate almak önemlidir. Bununla birlikte, yakın zamanda yapılan bir araştırma, Evans mavisinin BBB'nin olmadığı veya bozulduğu alanlarda birikmeye devam ettiğini gösterdi⁷. Bu özellik, Evans Blue'nun BBB arızasının geçmişini kaydetmesini sağlarken, FITC-dextran, BSW maruziyetinden sonra belirli bir zaman noktasında BBB arızasını kaydetmek için kullanıldı. Evans mavisi intravenöz veya intraperitoneal¹⁰ uygulanabilmesine rağmen, zamana duyarlı deneyler için intravenöz uygulama tercih edilir. Bu çalışma, BSW'ye maruz kaldıktan sonra BBB bozulmasının uzay-zamansal dağılımını tespit etmek için Evans mavisi ve FITC-dekstran kullanımını göstermeyi amaçladı.

İkinci olarak, çalışma, BBB parçalanmasının floresansını gözlemledikten ve immünohistokimyasal prosedürlere uygun daha ince dilimler hazırladıktan sonra beyin dilimlerini dondurmak için bir teknik sundu. Gliserolün bir montaj ortamı ve kriyoprotektan olarak kullanılması, immünohistokimya sürecini basitleştirir. BBB parçalanmasının görüntüleri immünohistokimyadan elde edilenlerle karşılaştırılarak, BBB parçalanmasının uzay-zamansal dağılımı aynı örneğin doku yanıtı ile ilişkilendirilebilir.

Protokol

Tüm deneyler, Ulusal Savunma Tıp Koleji (Tokorozawa, Japonya) tarafından belirlenen hayvan deneyleri için etik kurallara uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma protokolü, Ulusal Savunma Tıp Koleji'ndeki Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylandı (onay no. 23011-1). Bu çalışmada 8 haftalık ve 19-23 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tek bir BSW maruziyetine bağlı olarak çeşitli zaman noktalarında tek bir Evans mavisi enjeksiyonu ve FITC-dekstran perfüzyonu gerçekleştirildi. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Anestezi

NOT: Bu, medetomidin miktarını orijinaline kıyasla 2,5 kat artıran modifiye edilmiş bir protokoldür¹². Medetomidin hidroklorür, midazolam ve butorphanol için dozajlar sırasıyla 0.75 mg / kg, 4 mg / kg ve 5 mg / kg idi.

1. Fizyolojik tuzlu su içinde medetomidin hidroklorür (75 μg/mL), midazolam (400 μg/mL) ve butorphanol (500 μg/mL) karışımı hazırlayın.
2. Fareyi uyuşturmak için karışımı intraperitoneal olarak uygulayın (10 μL / g)¹³.
3. Yaklaşık 5-10 dakika sonra, kuyruk sıkışması ve pedal çekme reflekslerinin olmadığını gözlemleyerek yeterli anesteziyi doğrulayın.
4. Anestezinin etkilerinden kurtulana kadar fareyi sıcak tutun.

2. BSW'ye maruz kalma

NOT: Bu çalışmada kurum içi bir şok tüpü kullanılmıştır¹⁴.

1. Fareyi adım 1'de anlatıldığı gibi uyuşturun.
2. Fareyi şok tüpünün çıkış ucundan 5 cm uzağa yerleştirin ve vücut ekseninin tüpün eksenine paralel olduğundan ancak tüpün ekseniyle hizalanmadığından emin olun.
3. Kafaya 25 kPa'lık bir tepe aşırı basıncı ile tek bir BSW maruziyeti sağlayın.
   NOT: Anestezinin etkilerinden kurtulana kadar fareyi sıcak tutun. Tedavi edilen farenin durumunu düzenli olarak izleyin. Beslenme veya içme güçlüğü, kamburluk veya iyileşme belirtisi olmadan uzun süreli anormal görünüm gibi sıkıntı belirtileri gözlenirse, fareye ötenazi yapın ve deneyi erken sonlandırın. Glial yanıtı potansiyel olarak etkileyebileceğinden analjezik uygulamaktan kaçının.

3. Kuyruk damarına Evans mavisi enjeksiyonu

NOT: Evans mavisi solüsyonu anestezi olmadan intravenöz olarak uygulanmalıdır. Anestezi varlığında, boya genellikle vücuda yeterince nüfuz etmez, muhtemelen kan basıncının ve vücut sıcaklığının düşmesi nedeniyle¹³. Evans mavisi 100 mg / kg'lık bir dozda uygulandı.

1. Evans mavisi solüsyonunu (tuzlu suda %4 w/v) bir mikrotüpte hazırlayın, ardından girdap yapın ve kullanmadan önce karanlıkta saklayın.
2. Solüsyonu kuyruk damarına enjekte edin (2,5 μL/g)¹³.

4. FITC-dekstran çözeltisi ile transkardiyal perfüzyon ve fiksasyon

1. 1 U / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için fosfat tamponlu saline (PBS) heparin ekleyin, daha sonra 3 mg / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için heparinize PBS'ye FITC-dekstran ekleyin.
2. Kullanmadan önce FITC-dekstran tozunu tamamen çözün. Bunu yapmak için, çözeltiyi 30 dakika veya daha uzun süre hafifçe çalkalayın. Kullanmadan önce, çözünmemiş FITC-dekstran tozu olup olmadığını dikkatlice kontrol edin. Herhangi bir kalıntı varsa, tamamen eriyene kadar çalkalamaya devam edin.
3. Fareyi adım 1'de anlatıldığı gibi uyuşturun.
4. Peristaltik bir pompa^15,16 kullanarak standart perfüzyon fiksasyon protokolüne devam edin. İlk olarak, FITC-dekstran içeren heparinize PBS ile 4.0 mL / dk hızında 2 dakika perfüz. Daha sonra,% 10 formalin nötr tampon çözeltisi veya% 4 paraformaldehit-PBS ile 4.0 mL / dk oranında 2 dakika, ardından 3.5 mL / dk hızında 8 dakika perfüz.
5. Cerrahi makas ve cımbız kullanarak beyni dikkatlice çıkarın^15,16. Diseksiyondan sonra, beyni gece boyunca aynı fiksatifte (ör.% 10 formalin nötr tampon çözeltisi veya% 4 paraformaldehit-PBS) 4 ° C'de.
6. Ertesi gün, sabitleyiciyi PBS ile değiştirin.

5. Beyin dokusu işleme

NOT: Perfüzyon fiksasyonu tamamlansa bile, Evans mavisi ve FITC-dekstran tampona dağılabilir. Bu nedenle, adım 6.8'e kadar olan prosedürler perfüzyon fiksasyonundan sonraki bir hafta içinde tamamlanmalıdır. Ek olarak, numuneyi ışığa maruz bırakmaktan kaçının.

1. Her oyukta fosfat tamponunda (PB; pH 7.4) 500 μL% 20 gliserol içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın.
2. Bir beyin dilimleyici kullanarak, beyni koronal olarak her biri 1 mm kalınlığında 12 dilim halinde kesin.
3. Her dilimi 24 oyuklu plakanın ilgili kuyucuğuna aktarın ve en az 2 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
4. Çözeltiyi %50 gliserol-PB ile değiştirin ve en az 2 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
5. Son olarak, çözeltiyi% 100 gliserol ile değiştirin. Anında mikroskobik gözlem için, dilimlerin oda sıcaklığında en az 2 saat bekletilmesine izin verin veya 4 °C'de saklayın. Dilimler şimdi yarı saydam olacak ve mikroskobik gözlem için hazır olacak.

6. Boya ekstravazasyonunun floresan ölçümü

NOT: Floresan etiketleme verimliliği fareden fareye değişir. Bu nedenle, floresan yoğunluğunun normalleştirilmesi gerekir. Floresan değerleri, gigantosellüler retiküler çekirdek (GRN) içindeki değerlere göre ifade edilir, çünkü bu bölge BSW tedavisinden minimum düzeyde etkilenir.

1. 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağın dibine 500 μL gliserol ekleyin.
2. Dilimi gliserol çözeltisine aktarın ve yüzeyini bir örtü camı ile kaplayın.
3. Kapak camının kenarındaki fazla gliserol'ü çıkarın.
4. Floresan mikroskobu altında dilimin floresan yoğunluğunu ölçün.
5. Mikroskobik ölçümden sonra dilimi kuyuya geri koyun.
6. 12 dilimin tümü için ölçümü tekrarlayın.
7. Her kuyucuğa 500 μL PB ekleyin ve 24 oyuklu plakayı gece boyunca 4 °C'de saklayın; ertesi gün dilimler %50 gliserol-PB ile doyurulacaktır.
8. Solüsyonu %30 gliserol-PB ile değiştirin ve en az 2 saat 4 °C'de saklayın.
9. 7. adımdaki prosedürleri birkaç hafta içinde gerçekleştirin.

7. Kriyoseksiyon ve immünohistokimya

1. Kuyu 1'e 1000 μL eşit hacimlerde doku dondurma ortamı ve% 30 gliserol-PB karışımı ekleyerek 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Daha sonra, kuyu 2'ye 1000 μL doku dondurma ortamı ekleyin.
2. Dilimi 1 numaralı kuyuya aktarın ve plakayı 4 °C'de 1 saat çalkalayın.
3. Dilimi kuyu 2'ye aktarın ve plakayı 4 °C'de 1 saat çalkalayın.
4. Dilimi bükmemeye dikkat ederek kuru buz kullanarak dilimi izopentan ile hızlı bir şekilde dondurun. Dilimleri kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
5. Dilimi 6 μm kalınlığa kadar kriyoseksiyon. Mikroskop lamı üzerinde kuruduktan sonra kesitleri -80 °C'de saklayın.
6. Antijen alımı¹⁷ için, bölümleri 10 mM sodyum sitrat (pH 6.0) içine daldırın, bir kez 100 °C'ye ısıtın ve ardından 1 saat boyunca 98 °C'de tutun.
7. Bölümleri damıtılmış suda iyice yıkayın. Kesitler artık immünohistokimyasal boyama için hazırdır.

Sonuçlar

Şekil 1A , 25 kPa'lık bir tepe aşırı basıncı ile BSW'nin başlangıcına göre boya enjeksiyonunun zaman seyrini göstermektedir. 'Post' protokolünde, Evans blue solüsyonu, BSW maruziyetinden 6 saat, 1 gün, 3 gün ve 7 gün sonra gerçekleştirilen FITC-dekstran perfüzyonundan 2 saat önce intravasküler olarak uygulandı. 'Ön' protokolde, BSW maruziyetinden hemen önce Evans mavisi çözeltisi enjekte edildi. 'Post' protokolünde, Evans mavisi k...

Tartışmalar

Tek bir beyinde BBB parçalanmasının kesin uzay-zamansal dağılımını doğru bir şekilde görselleştirmek için Evans mavisi ve FITC-dekstran kullanan yeni bir çift etiketleme tekniği kullanıldı. Düşük yoğunluklu BSW modelinde, incelenen beyinlerde boya ekstravazasyonunun kapsamı, yeri ve derecesinde gözle görülür değişiklikler gözlenmiştir (Şekil 2 ve Şekil 3). Boyalar arası uyumsuzluklar, BBB bozulma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol