Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Özet

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Özet

Drosophila'daki transgenez, organizma düzeyinde gen fonksiyonunu incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, transgenik sineklerin inşası için çok önemli bir adımdır. Mikroenjeksiyon, bir mikroenjektör, bir mikromanipülatör, bir ters mikroskop ve bir stereo mikroskop dahil olmak üzere bazı ekipman türleri gerektirir. Bir plazmid miniprep kiti ile izole edilen plazmitler mikroenjeksiyon için uygundur. Çekirdeklerin ortak bir sitoplazmayı paylaştığı blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasındaki embriyolar mikroenjeksiyona tabi tutulur. Bir hücre süzgeci, embriyoların dekoryona ayrılma sürecini kolaylaştırır. Embriyoların dekoryonasyonu ve kuruması için en uygun zamanın deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyonunun etkinliğini artırmak için, bir çektirme tarafından hazırlanan iğnelerin bir iğneli öğütücü ile pahlanması gerekir. İğneleri taşlama sürecinde, iğne ucunun kılcal etkisini önlemek için manometreli bir ayak hava pompası kullanıyoruz. Her plazmit için rutin olarak 120-140 embriyo enjekte ediyoruz ve plazmitlerin yaklaşık% 85'i için en az bir transgenik hat elde ediyoruz. Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Meyve sineği Drosophila melanogaster, genetik manipülasyon ve genetik analiz için son derece uygundur. Transgenik meyve sinekleri biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. 1980'lerin başında geliştirildiğinden beri, P-element transpozon aracılı transgenez, Drosophila araştırması için vazgeçilmez olmuştur¹. Bazı senaryolarda, Drosophila'da transgenez için piggyBac ve Minos gibi diğer transpozonlar da^{kullanılmıştır 2}. Transpozon yoluyla transgenler rastgele Drosophila genomuna yerleştirilir ve farklı genomik lokuslardaki transgenlerin ekspresyon seviyeleri pozisyon etkiler....

Protokol

1. Plazmitlerin hazırlanması

1. Bir plazmid miniprep kiti kullanarak gece boyunca 4 mL bakteri kültürlerinden plazmitleri izole edin. 40 μL elüsyon tamponu ile elute.
   NOT: Bir plazmit midi hazırlama kiti kullanılarak plazmitlerin izolasyonu gerekli değildir. Bir plazmid miniprep kiti, embriyo mikroenjeksiyonu için deneysel gereksinimleri tam olarak karşılayabilir. Bu protokolde, hazırlanan UAS-cDNA/ORF plazmitleri, UAS'ın on kopyası, bir Hsp70 minimal promotörü, bir attB bölgesi, bir mini-beyaz gen ve ilgilenilen bir gen içerir.
2. Bir spektrofotometre kullanarak plazmit DNA konsantrasyonunu belirleyin ve -80 °C dondurucuda saklayın.<....

Tartışmalar

Burada, Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz. phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenez için, her plazmit için 120-140 embriyo enjekte ettik ve plazmitlerin yaklaşık %85'i için en az bir transgenik hat elde ettik (Ek Tablo 2). Deneyimlerimize göre, bir plazmit miniprep kiti ile izole edilen plazmit DNA, Drosophila'da transgenez için yeterlidir. 20 ng/μL ila 1683 ng/μL arasında değişen plazmit DNA konsantrasyonları, transgene.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745