Hasta Kaynaklı Tümör Organoidlerinde Hücresel Radyosensitiviteyi Ölçmek için Canlı Görüntüleme

Özet

Burada, hasta kaynaklı tümör organoidlerinin iyonlaştırıcı radyasyona duyarlılığını ölçmek için basit bir canlı görüntüleme yaklaşımını detaylandırıyoruz.

Özet

Radyasyon tedavisi (RT), modern klinik kanser yönetiminin temel dayanaklarından biridir. Bununla birlikte, tüm kanser türleri, kötü huylu hücrelerin iyonlaştırıcı ışınlar tarafından ortaya çıkan oksidatif DNA hasarını onarma yeteneğindeki farklılıklar nedeniyle, sıklıkla (ancak her zaman değil) ışınlamaya eşit derecede duyarlı değildir. Klonojenik tahliller, kültürlenmiş kanser hücrelerinin iyonlaştırıcı ışınlamaya duyarlılığını değerlendirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır, çünkü büyük ölçüde ışınlanmış kanser hücreleri genellikle kısa süreli akış sitometrisi veya mikroskopi destekli tekniklerle ölçülmesi zor olan gecikmeli bir şekilde ölür. Ne yazık ki, klonojenik tahliller, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDTO'lar) gibi daha karmaşık tümör modelleri için bu şekilde kullanılamaz. Gerçekten de, yerleşik PDTO'ların ışınlanması, gövde benzeri bölmeleri tamamen ortadan kaldırılmadıkça, çok hücreli birimler olarak büyümelerini mutlaka iptal etmeyebilir. Ayrıca, PDTO'dan türetilmiş tek hücreli süspansiyonların ışınlanması, yerleşik PDTO'lar bağlamında malign hücrelerin RT'ye duyarlılığını uygun şekilde özetleyemeyebilir. Burada, yerleşik PDTO'ların iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmasını, ardından tek hücreli ayrışmayı, uygun kültür koşullarında yeniden kaplamayı ve canlı görüntülemeyi içeren geleneksel klonojenik testlerin bir adaptasyonunu detaylandırıyoruz. Işınlanmamış (kontrol) PDTO'dan türetilmiş kök benzeri hücreler, doza bağımlı bir şekilde ışınlamadan olumsuz etkilenen PDTO'ya özgü bir verimlilikle büyüyen PDTO'ları yeniden şekillendirir. Bu koşullarda, PDTO oluşturma verimliliği ve büyüme hızı, kontrol PDTO'ları önceden tanımlanmış bir alan doluluğuna ulaşana kadar toplanan hızlandırılmış görüntülerdeki radyosensitivitenin bir ölçüsü olarak ölçülebilir.

Giriş

Eksternal ışın radyasyon tedavisi (RT), modern onkolojinin temel dayanaklarından biridir ve yalnızca genel olarak yönetilebilir yan etkilerin iyi tanımlanmış bir spektrumu ile ilişkili belirgin bir antikanser aktivitesini¹ değil, aynı zamanda son derece yaygın bir klinik kullanılabilirliği de yansıtır (gelişmiş ülkelerdeki çoğu kanser merkezi, harici ışın RT için modern lineer hızlandırıcılarla donatılmıştır)². Bu düşünceye uygun olarak, RT, genellikle erken evre hastalık ^3,4 bağlamında hem iyileştirici amaçlar hem de metastatik tümörlerden

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Organoid kültürü

NOT: TBC#1 PDTO'lar, üçlü negatif meme kanseri (TNBC) olan ve bir biyobankacılık protokolüne (IRB21-06023682) katılmak için bilgilendirilmiş onam veren bir hastadan cerrahi olarak çıkarılan tümör dokusuna dayalı olarak laboratuvarımızda kurulmuştur. Histoloji ve RNA dizilimi (RNAseq) ile doğrulamadan sonra, TNBC # 1 PDTO'lar, zenginleştirilmiş DMEM / F12 kültür ortamında% 66 matrigel damlalarında ('kubbeler' olarak adlandırılır) kültürlenir ve her 2....

Tartışmalar

Burada, (1) in vitro PDTO ışınlaması üzerine PTDO oluşturan kök benzeri hücrelerin kalıcılığına ve (2) bu hücrelerin üretebileceği PDTO'ların büyüme hızına dayalı olarak PDTO radyosensitivitesini ölçmek için meme kanseri PDTO'larından ve canlı görüntülemeden yararlanan geleneksel klonojenik testlerin bir adaptasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün kritik adımları şunları içerir: (1) PDTO'ların iyi canlılık sağlayan bir kubbe doluluğuna ku.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049