Murin Dalak Dokusu Oluşumunu Araştırmak için Bazal Membran Matris Kapsüllü Hücre Agregasyonu

Özet

Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.

Özet

Dalak, kan yoluyla bulaşan bağışıklık tepkilerinde önemli bir rol oynayan bir bağışıklık organıdır. Bu dokunun anatomik veya fonksiyonel kaybı, ciddi kan enfeksiyonlarına ve sepsise yatkınlığı artırır. Dalak dilimlerinin ototransplantasyonu, kaybedilen dokuyu değiştirmek ve bağışıklık fonksiyonunu eski haline getirmek için klinik olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sağlam ve immünolojik olarak fonksiyonel dalak dokusu rejenerasyonunu yönlendiren mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Burada, dalak dokusu oluşumu için hücresel gereksinimleri araştırmak amacıyla dalak hücrelerini yarı katı bir matriks içinde toplamak ve kapsüllemek için bir yöntem geliştirmeyi amaçlıyoruz. Bazal membran matris kapsüllenmiş hücre yapıları, hem üç boyutlu organoidlerin in vitro doku kültürüne hem de doğrudan in vivo doku oluşumunu değerlendirmek için böbrek kapsülü altına transplantasyona uygundur. Agregasyon ve kapsülleme için giriş hücrelerini manipüle ederek, hayvan nakli modelleri altında dalak dokusu rejenerasyonu için greft kaynaklı PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- neonatal stromal hücrelerin gerekli olduğunu gösterdik.

Giriş

Dalağın travmatik rüptürü ve vücutta çok sayıda dalak nodülünün ortaya çıkması, dalak dokusunun rejeneratif kapasite barındırdığının ilk göstergelerinden biriydi ^1,2. Dalak ototransplantasyonları daha sonra acil splenektomi gerektiren hastalarda dalak dokusunu korumak için kliniğe tanıtıldı³. Yine de, onlarca yıldır klinik uygulamanın bir parçası olmasına rağmen, dalağın nasıl yenilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Hayvan nakli modelleri, dalak rejenerasyonu ve bağışıklık fonksiyonunun çoklu parametreleri hakkında fikir vermiştir ^4,5. Özellikle, greft hazırlama yönteminde yapılan deneysel modifikasyonlar, doku rejenerasyonunun hücresel ve moleküler düzeyde daha ayrıntılı olarak incelenmesine izin vermiştir.

Tüm dalak dilimlerini içeren transplantasyonlar, yeni bir dalak yapısı yeniden inşa edilmeden önce bir kitle nekrozu evresine girer⁶. Greft nekrozunun ilk aşaması, nakledilen dokunun büyük kısmının büyük ölçüde kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden oluştuğunu ve dalak rejenerasyonu için gereksiz olduğunu düşündürmektedir. Bu, fare böbrek kapsülü altına nakledilmeden önce hematopoietik hücrelerin dalak greftlerinden çıkarılmasıyla deneysel olarak araştırıldı. Burada, stromal ve endotel hücrelerini içeren dalağın lökosit olmayan/eritrosit olmayan fraksiyonunun, de novo doku oluşumunu indüklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir⁷. Dalak stromal dokusu, hücresel greft bileşimini manipüle etmek için hücre sıralama teknolojilerinin kullanılmasını sağlayan tek hücreli bir süspansiyona daha fazla işlenebilir. Aday hücre tiplerini seçici olarak çıkararak, greft gelişimi için vazgeçilmez olan iki CD45-TER-119-stromal hücre popülasyonu tanımlandı: endotel benzeri bir CD31 ⁺ CD105 ⁺ MAdCAM-1 ⁺ hücre popülasyonu ve daha geniş bir şekilde tanımlanmış bir PDGFRβ ⁺ mezenkimal hücre popülasyonu⁸.

Dalak hücrelerinden greft yapımı, destek materyalleri ve hücre yükleme işlemleri açısından farklılık gösterir. Doku mühendisliği ile tasarlanmış dalaklar daha önce bir poliglikolik asit/poli-L laktik asit polimer iskelesi ^5,9 üzerine dalak üniteleri yüklenerek hazırlanmıştı. İlginç bir şekilde, bir kollajen süngeri içine emilen dalak stromal hücreleri aşılamayı başaramazken, bir kollajen tabakası üzerine toplanan ve yüklenen stromal hücreler dalak rejenerasyonunu kolaylaştırdı⁸. Bir Matrigel matrisi içindeki dalak stromal hücrelerinin yeniden süspansiyonunun, üç boyutlu kültür koşulları altında hücre agregasyonunu indüklediği^{de gösterilmiştir 10}. Bununla birlikte, bu yöntem transplantasyon modellerinde kullanım için test edilmemiştir. Mevcut protokolün genel amacı, dalak stromal hücrelerini doğrudan bazal membran matrisi içinde zorla toplamak ve kapsüllemektir, bu daha sonra üç boyutlu bir in vitro doku kültürü sistemine aktarılabilir veya hayvan modeli transplantasyonları için bir araç olarak kullanılabilir (Ek Şekil 1).

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Queensland Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (UQBR/079/19) tarafından onaylanan deneysel protokollere göre yürütülmüştür.

1. Doku toplama ve stromal hücre hazırlama

1. 0.5-1.5 günlük erkek ve/veya dişi BALB/c yenidoğan donör fareleri, hayvanları kağıt mendilin içine sararak ve >10 dakika boyunca kırılmış buzun altına yerleştirerek hipotermi indüksiyonu ile ötenazi yapın.
   NOT: Bu protokol farklı fare türlerine, yaşlarına ve hayvan sayısına uyarlanabilir.
2. Steril cerrahi aletler hazırlayın.
3. Fareyi sağ yanal konuma getirin. Cildi %80 etanol ile sürüntü ve periton duvarını ortaya çıkarmak için Iris cerrahi makasıyla 1 cm'lik bir kesi yapın.
4. Dalağın üzerinde 0,5 cm'lik ikinci bir kesi yapın ve dokuyu nazikçe yukarı kaldırmak için bir çift ince forseps kullanın. Kan damarlarını kesmek ve dokuyu çıkarmak için bir çift cerrahi makas kullanın. Dokuyu buz gibi soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içeren bir Petri kabına aktarın. Dalağa bağlı kalan bağ dokusunu çıkarın.
   NOT: Bir stereomikroskop, cerrahi aletleri manipüle etmek için gereken ince motor hareketlerine yardımcı olabilir.
5. Tüm dokuları ayırmak için, yenidoğan dalaklarını (10 veya daha az havuzlar) ters çevrilmiş 14 mL konik tüp kapağının iç kenarına aktarın. 1 mL'lik bir şırınga pistonunun plastik arka ucunu kullanarak bir baskı hareketiyle dokuları mekanik olarak bozun.
6. Kapağı 10 mL soğuk PBS içeren 14 mL'lik konik bir tüpün üzerine sıkıca yerleştirin ve sabitleyin. Kapaktan tüpe bozulan tüm dokuları yıkamak için tüpü 5x ters çevirin.
7. Kalan doku için adım 1.6'yı tekrarlayın.
8. Dokunun tüpün dibine çökmesini sağlamak için tüpü 1 dakika buz üzerinde bırakın.
9. Çözeltiyi geri dönüşümlü 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek süpernatanı (hematopoietik hücreler içeren) dikkatlice atın.
10. 1 mg / mL Kollajenaz IV, 40 μg / mL DNaz I ve% 2 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren taze hazırlanmış 2 mL takviyeli Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (sDMEM) kullanarak süzgeci ters çevirerek ve stromal dokuyu 14 mL konik tüpe geri yıkayarak çözünmeyen stromal fraksiyonu geri kazanın.
    DİKKAT: Kollajenaz IV ve Kollajenaz D tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır.
11. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, havuzlanmış dokuyu (20'ye kadar) sabit rotasyonla 37 ° C'de 10 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin.
12. 1 mg/mL Kollajenaz D, 40 μg/mL DNaz I ve %2 FBS içeren 4 mL taze hazırlanmış sDMEM'i doğrudan stromal doku içeren tüpe ekleyin. Sabit dönüşle 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
13. 8 mL buz gibi PBS ekleyerek sindirimi durdurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyerek hücreleri toplayın.
14. Süpernatanı atın ve 1 mL soğuk PBS'de yeniden süspanse ederek ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri buz üzerinde tutun.
    NOT: Hücreler sayılabilir ve istenen konsantrasyona ayarlanabilir. Bu, farklı hücre popülasyonları için optimizasyon gerektirebilir. Bu protokolü kullanarak, donör farelerin yaşına bağlı olarak tipik olarak 0.5 x 10^6-1 x 10⁶ stromal hücreler / dalak geri kazanılır. Hücreler isteğe bağlı olarak boyanabilir ve hücre kompozisyonunu tanımlamak için bu aşamada FACS sıralanabilir.

2. Hücre agregalarının matris kapsüllenmesi

1. Steril P200 pipet uçlarını -20 °C'lik bir dondurucuda önceden soğutun.
2. Esnek laboratuvar filmini (örneğin Parafilm) 1 cm x 2 cm'lik parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca %80 etanole, ardından 10 dakika PBS'ye batırarak sterilize edin. Laboratuvar filmi önceden hazırlanabilir ve steril olarak saklanabilir.
3. 0.5 x 10 6-2.5 x 10⁶ hücrelerini 200 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek hazırlayın. Kalan PBS hacminin yaklaşık 20 μL'sini bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini buz üzerinde tutun.
   NOT: Kalan PBS, hacmi doğrulamak için hücre peletini bozmadan nazikçe aspire edilebilir.
4. Bir P20 pipetleyici kullanarak 2 μL buz gibi soğuk bazal membran matrisini önceden soğutulmuş bir P200 pipet ucuna aspire edin.
   NOT: Yüksek konsantrasyonlu bir bazal membran matrisi (örneğin, Corning Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon), güçlü bir katılaşmış tıkaç oluşturmaya yardımcı olur.
5. Pipet ucunu çıkarmak için hafifçe çevirin. Laboratuvar filminin önceden sterilize edilmiş bir şeridini gerin ve filmi delmemeye dikkat ederek pipet ucunun ucuna yerleştirin. Pipet ucunu kapatmak için ucu filme sarmaya devam edin. Filmi yırtmamaya dikkat ederek kapalı ucu dikkatlice doğrudan buzun üzerine yerleştirin.
6. Kalan PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin ve çözeltiyi bazal membran matrisinin üzerine nazikçe katmanlayın. Yapıyı buz üzerinde tutun.
7. 1.2 mL'lik bir konik tüpün içine 14 mL'lik bir küme tüpü yerleştirerek bir santrifüj tüpü hazırlayın.
8. Pipet ucunu iç içe geçmiş tüp konfigürasyonunun içine yerleştirin ve 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
9. 14 mL konik tüpü dikey yönde konumlandırın ve bazal membran matrisinin pipet ucunun içinde katılaşmasını sağlamak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: 14 mL konik boru, aşağı akış uygulaması için gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir.

3. Üç boyutlu organoid kültür

1. Laboratuvar filmini pipet ucundan dikkatlice çıkarın.
2. Pipet ucunun daha büyük açıklığından ince bir paslanmaz çelik tel piston sokun.
3. Matris tapasını uçtan serbest bırakılana kadar, %10 FBS, 1x Glutamax, 1x Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA), 10 μM Kaya İnhibitörü, 10 U/mL Penisilin / Streptomisin ve 50 μM β-merkaptoetanol ile desteklenmiş 2 mL sDMEM içeren işlem görmemiş 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna boşaltın.
   NOT: Doku kültürü kabı ve ilgili ortam hacmi gerektiği gibi ayarlanabilir.
   DİKKAT: NEAA, Penisilin/Streptomisin ve β-merkaptoetanol tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır.
4. 4-12 hafta boyunca 37 °C, %5_CO2 ve %95 nemde kültür organoidleri.
5. Ortamın yarısını her 5 günde bir değiştirin.
   NOT: Organoidler doku kültürü plakasına bağlanmaya başlarsa, taze bir kuyucuğa aktarın.

4. Böbrek kapsülü nakli

1. Steril cerrahi aletler hazırlayın.
2. Bazal membran matris tıkacının subkapsüler böbrek naklini gerçekleştirin:
   1. Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine uygun olarak 8 haftalık BALB/c dişi alıcı fareyi izofluran ile uyuşturun.
      DİKKAT: İzofluran tehlikeli bir maddedir. Çalışma ortamı içerisine girilmesi engellenen atık gazların temizlenmesi gerekmektedir.
   2. Fareyi sağ yanal konuma getirin.
   3. Ameliyat bölgesindeki saçları tıraş edin ve Kurumsal Yönergelere uyarak cildi dezenfekte edin.
      NOT: Cerrahi bölgenin alternatif iyot bazlı veya klorheksidin bazlı ve alkol bazlı fırçalama ile dairesel hareketlerle üç kez dezenfekte edilmesi önerilir.
   4. Periton duvarını ortaya çıkarmak için omurgaya dik deride 2 cm'lik bir kesi yapın.
      NOT: Cilt kesisi için ince cerrahi makas veya neşter bıçağı kullanılabilir. Kullanıcılar, Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine veya Standart Çalışma Prosedürlerine uymalıdır.
   5. Böbreğin üzerindeki periton duvarında 0,5 cm'lik daha küçük bir kesi yapın.
      NOT: Nakil sırasında böbreğin dışarıda kalmasını sağlamak için kesi böbrek genişliğine yaklaşmalıdır.
   6. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak aşağı doğru basınç uygulayarak böbreği periton açıklığından dışarı çıkarın. Dışsallaştırmaya yardımcı olmak için bir çift halka cımbız kullanılabilir. Pamuklu çubuk kullanarak düzenli olarak steril PBS uygulayarak böbreğin işlem boyunca nemli olduğundan emin olun.
   7. Bir stereomikroskop altında, böbrek kapsülünün perirenal yağını böbreğin bir kutbunda bir çift bükülmüş ultra ince forseps ile sıkıştırın. Böbrek kapsülü zarını ters yönde yukarı doğru nazikçe yırtmak ve küçük bir açıklık oluşturmak için ikinci bir çift bükülmüş ultra ince forseps kullanın.
   8. Bir forsepsin ucunu kapsül zarının altına dikkatlice yerleştirin. Kapsül zarını böbrek parankiminden ayırmak için yavaş bir süpürme hareketi kullanın.
   9. Laboratuvar filmini pipet ucundan çıkararak bazal membran matris tapasını nakil için hazırlayın.
   10. Forsepsin bir ucunu kullanarak böbrek kapsülünü kaldırın ve pipet ucunu böbreğin karşı kutbuna doğru iterek açıklıktan geçirin.
   11. Pipet ucuna bir tel piston yerleştirin ve aynı anda pipet ucunu böbrekten çekerken matris tapasını çıkarın.
   12. Böbreği PBS ile nemlendirin ve yeniden içselleştirin.
   13. Periton duvarını bir adet 5-0 Vicryl sütür ile kapatın ve cildi iki otoklips ile kapatın.
   14. Analjezik uygulayın (0.05-0.1 mg / kg'da Buprenorfin, deri altından veya Kurumsal Hayvan Etik Kurallarına uyarak).
       DİKKAT: Buprenorfin tehlikeli bir maddedir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır.
3. İzofluran akışını kapatın, ancak farenin bilinç kazanmaya başlayana kadar saf oksijen solumasına izin vermek için oksijen akışını açık tutun.
4. Fareyi kafesine geri koyun. Kafesi kısmen bir ısıtma yastığının üstüne veya bir ısı lambasının altına yerleştirerek iyileşme sırasında hayvanı sıcak tutun ve fare anesteziden tamamen kurtulana kadar izleyin.
5. Ameliyat sonrası iyileşmeyi ilk iki hafta boyunca veya Kurumsal Yönergelerin gerektirdiği şekilde izleyin.

Sonuçlar

Hücre agregasyonu, hücreden hücreye teması ve sinyalleşmeyi teşvik etmek için önemlidir. Bazal membran matrisi içindeki hücre agregatlarının kaplanması, in vitro doku organoid oluşumu için hem 3 boyutlu kültürleri destekledi hem de greft nakli için hücrelerin böbrek kapsülüne mekanik olarak verilmesini kolaylaştırdı. Bu yapıları oluşturmak için, bazal membran matrisi ilk önce buz gibi soğuk koşullar altında akışkan bir durumda tutuldu. Hücre agregasyonu daha sonra, konsantre b...

Tartışmalar

Yenidoğan dalak hücrelerinin yarı katı bir ortam içinde toplanması, dalak yapıları oluşturmak için uygun bir yöntemi temsil eder. Üç boyutlu dalak kültürlerini başlatmak için benzer bazal membran matris tabanlı protokoller kullanılmıştır¹⁰. Burada, dalak yapılarının in vitro organoid kültür sistemlerine ve in vivo transplantasyon modellerine eşit derecede uygun olduğunu gösteriyoruz. Dikkat çekici bir şekilde, in vitro kültürlenmiş dala...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm