Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Özet

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Özet

Memeli kalbi, gelişim sırasında çok çeşitli progenitör hücre popülasyonları yoluyla oluşan karmaşık bir organdır. Bu ataların kökeni, işe alınma zamanlaması ve kaderi, bu organın düzgün gelişimi için hayati önem taşır. Kalbin morfogenezini yöneten moleküler mekanizmalar, konjenital kalp hastalıklarının ve embriyonik kardiyak rejenerasyonun patogenezini anlamak için gereklidir. Bu mekanizmaları araştırmak için klasik yaklaşımlar, kardiyak gelişim sırasında spesifik genlerin işlevini değerlendirmek için transgenik farelerin neslini kullanmıştır. Bununla birlikte, fare transgenezi, kalp gelişimi sırasında belirli genlerin rolünü değerlendirmek için genellikle gerçekleştirilemeyen karmaşık, zaman alıcı bir süreçtir. Bunu ele almak için, fare embriyonik kalplerinin verimli elektroporasyonu ve kültürü için bir protokol geliştirdik ve geçici transgenezin kardiyak gelişimde yer alan genlerin fonksiyon kazanımı veya kaybının etkisini hızlı bir şekilde değerlendirmesini sağladık. Bu metodolojiyi kullanarak, epikardiyal hücre transfeksiyonu tercihi ile embriyonik kalpte Meis1'i başarılı bir şekilde aşırı eksprese ettik ve tekniğin yeteneklerini gösterdik.

Giriş

Kalp, embriyonik gelişim sırasında oluşan ilk organdır. Bu süreç, embriyonun farklı bölgelerinden çeşitli progenitör hücre popülasyonlarının uzay-zamansal koordinasyonunu içerir. Bütün bunlar, gelişmekte olan kalp atmaya ve çalışmaya devam ederken meydana gelir ve oluşumu için gereken olağanüstü koordinasyonu vurgular ^1,2,3. Kalbin kritik rolü göz önüne alındığında, düzgün oluşumu için hücresel ve moleküler seviyelerde sıkı düzenleme şarttır ^4,5. Kalp gelişimini kontrol eden mekanizmaların belirlenmesi, dünya çapında ....

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, CNIC Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı ve 53/2013 sayılı Gerçek Kararname uyarınca İspanyol Yasası tarafından uygulanan AB Direktifi 2010/63EU ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı dahil olmak üzere mevcut mevzuata uygun hale getirildi. Bu protokol için, 15-21 haftalık dişi vahşi tip CD-1 fareleri kullanıldı. Kullanılan hayvanlar, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Plazmit ve alet hazırlama

1. İlk olarak, istenen plazmit DNA'yı 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyonda buza ekleyerek elektroporasyon karışımını hazır....

Tartışmalar

Genel olarak, burada açıklanan metodoloji, Meis1 aşırı ekspresyonu (Şekil 4C) ile gösterildiği gibi, gelişmekte olan epikarddaki transgenik yapıları ifade etmek için sağlam bir çerçeve sunar (Şekil 4B). Uygun yapılarla, bu protokol, belirli bir genin fonksiyon kazancının (GOF) veya fonksiyon kaybının (LOF) etkisini geçici olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LOF, RNA interferansı²⁶ yoluyla bir aday geni hed.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5