Antibakteriyel Grafen Oksit / Bakır Nanokompozitlerin İmalatı

Özet

Burada, antibakteriyel bir nanomalzeme olarak grafen oksit / bakır (GO / Cu) nanokompozitlerini tanıtıyoruz. GO / Cu nanokompozitlerinin antibakteriyel etkinliği hem antibiyotiğe dirençli gram pozitif hem de gram negatif bakterilere karşı değerlendirildi.

Özet

Antibiyotikler şu anda bakterileri öldürmek için en çok kullanılan antibakteriyel tedavidir. Bununla birlikte, bakteriler sürekli olarak antibiyotiklere aşırı maruz kaldıklarında direnç geliştirir. Mevcut antibiyotiklerin yerini alabilecek antimikrobiyal ajanların geliştirilmesi esastır, çünkü antibiyotiğe dirençli bakteriler mevcut tüm antibiyotikler için direnç mekanizmalarına sahiptir ve hastane enfeksiyonlarını teşvik edebilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu çalışmada, mevcut antibiyotiklerin yerini alabilecek antibakteriyel malzemeler olarak grafen oksit / bakır (GO / Cu) nanokompozitleri öneriyoruz. GO / Cu nanokompozitler, transmisyon elektron mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edilir. Bakır (Cu) nanopartiküllerinin grafen oksit tabakaları üzerinde iyi büyüdüğünü gösteriyorlar. Ek olarak, antimikrobiyal maddenin sıklıkla hastane enfeksiyonlarında rol oynayan metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve Pseudomonas aeruginosa'ya (P. aeruginosa) karşı etkinliğini doğrulamak için bir mikrodilüsyon suyu yöntemi kullanılır. Spesifik olarak, MRSA'nın %99.8'i ve P. aeruginosa'nın %84.7'si 500 μg/mL GO/Cu nanokompozitler tarafından elimine edilir. Metal nanokompozitler, iyonları serbest bırakarak, reaktif oksijen türleri oluşturarak ve bakterilere fiziksel olarak zarar vererek antibiyotiğe dirençli bakterileri yok edebilir. Bu çalışma, antibakteriyel GO / Cu nanokompozitlerin antibiyotiğe dirençli bakterileri yok etme potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Bakteriyel enfeksiyonların halk sağlığı üzerinde önemli bir etkisi vardır. Özellikle patojen bakteriler vücudun koruyucu mekanizmalarından kaçabilir ve hastalıklara neden olabilir¹. Antibiyotikler, bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, antibiyotiklerin uygunsuz kullanımı, antibiyotiğe dirençli bakterilerin ortaya çıkmasını hızlandırmıştır. Günümüzde, antibiyotiğe dirençli bakterilere atfedilebilen hastane enfeksiyonları, sağlık tesislerinde önemli komplikasyonlara neden olmuştur². Ne yazık ki, bakteriler mevcut tüm antibiyotikler için direnç mekanizmalarına sahiptir³. Bu nedenle yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi elzemdir, ancak direnç mekanizmalarının ortaya çıkma olasılığı da yüksektir.

Metal nanopartiküller, etkili antibakteriyel özellikleri nedeniyle antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadelede umut verici ajanlar olarak ortaya çıkmıştır ^4,5,6. Bakterilerin metal nanopartiküllere karşı direnç mekanizmaları geliştirmesi zordur çünkü herhangi bir spesifik bakteri reseptörüne bağlanmazlar⁷. Özellikle, gümüş, bakır ve çinko oksit nanopartikülleri, dikkate değer antibakteriyel etkinlikleri^nedeniyle kapsamlı araştırmaların odak noktasıdır 8,9,10,11,12,13. Metal nanopartiküllerin bakterilere karşı toksisitesi üç ana mekanizmaya atfedilir: 1) metal iyonlarının salınması, 2) •OH ve •O₂⁻ gibi reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretilmesi ve 3) fiziksel etkileşim ve bağlanma ^4,14.

Bu çalışmada, antimikrobiyal ajan olarak grafen oksit/bakır (GO/Cu) nanokompozitler geliştirilmiştir. Bakır (Cu), yüzeyiyle karşılaşan patojenleri etkili bir şekilde öldürür ve bakteriyel gen replikasyonuna müdahale eder. Bununla birlikte, insan vücudunda önemli bir mikro elementtir ve memeli hücreleri için daha az toksiktir çünkü hücrelerin içindeki Cu konsantrasyonlarını düzenleyen homeostatik mekanizmalara sahiptir⁴. Cu nanopartikülleri oksitlendiğinde, negatif yüklü bakteriler için nispeten yüksek bir afiniteye sahip olan Cu iyonları üretirler^15,16. Cu iyonları hücresel yapılara (örneğin proteinler, zarlar ve DNA) bağlanarak hücre fonksiyonlarını bozar¹⁷. Grafen oksit (GO) yüzeyinde Cu nanopartikülleri sentezleyerek, metal iyonlarının salım hızı kontrol edilebilir 18,19,20. GO ayrıca oksidatif stres yoluyla pürüzlü bir yüzeye bakteri yapışmasını önleyerek veya ROS^21,22 oluşturarak antibakteriyel bir etki gösterir. Ayrıca, GO/Cu nanokompozitler, bakteri proteinlerine ve DNA'ya zarar veren ve bakterilerin ölümüne yol açan Cu²⁺'nın kimyasal etkisiyle GO'dan daha fazla ROS salgılar^23,24.

Bu makale, GO / Cu nanokompozitlerinin sentezlenmesi için protokolü özetlemekte ve hastane enfeksiyonlarına neden olan en yaygın çoklu ilaca dirençli bakteri suşları olan klinik bakteriler MRSA ve P. aeruginosa'ya karşı bir antimikrobiyal test yaklaşımı sunmaktadır²⁵. Bu protokol, antibiyotiğe dirençli bakterilerin büyümesini engelleyebilecek GO / Cu nanokompozitlerinin sentezlenmesi için basit bir kimyasal indirgeme yöntemi sunmayı amaçlamaktadır. Öncü ve indirgeyici ajan olarak sırasıyla bakır (II) klorür (CuCl₂) ve sodyum borhidrür (NaBH₄) kullanıyoruz. Protokol ayrıca, bu nanokompozitlerin mikrodilüsyon suyu yöntemi kullanılarak bakterilere uygulanmasının özelliklerini de açıklar. Metal nanopartiküllerin absorpsiyon girişiminden kaynaklanan hataları dışlamak ve doğru değerlendirmeler yapmak için, antibakteriyel yetenek koloni sayımı yöntemi kullanılarak değerlendirilir.

Protokol

1. GO / Cu nanokompozitlerinin hazırlanması

NOT: GO nano tabakaları üzerinde büyüyen Cu nanopartiküllerinin boyutu ve morfolojisi, GO oksidasyon derecesi, Cu öncüsünün konsantrasyonu ve indirgeyici ajanın²⁶ konsantrasyonu ile belirlenir.

1. Bir cam şişede 10 mL 1 mg / mL GO süspansiyonu hazırlayın. GO damıtılmış (DI) suda iyice dağılana kadar GO süspansiyonunu 1 saat boyunca sonikleştirin.
2. Bir cam şişede 20 mM CuCl₂ çözeltisi hazırlayın. CuCl₂ çözeltisini, CuCl₂ DI suyunda iyice dağılana kadar sonikleştirin.
3. GO çözeltisine 10 mL 20 mL CuCl₂ çözeltisi ekleyin ve karışımı 1 saat boyunca 70 ° C'de sonikleştirin.
4. 20 mM NaBH₄ çözeltisi hazırlayın.
   DİKKAT: Bu prosedür kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır. İndirgeyici ajan NaBH₄ suya verilir verilmez bir redoks reaksiyonu meydana gelir. Deneyden hemen önce NaBH₄ çözeltisini hazırlayın.
5. NaBH₄, GO ve CuCl₂ karışımının hazırlanması
   1. 200 rpm'de manyetik bir çubukla karıştırırken GO ve CuCl₂ karışımına 20 mL 20 mL NaBH₄ çözeltisi ekleyin. NaBH₄ çözeltisini ekledikten sonra 30 dakika boyunca sürekli karıştırın.
      DİKKAT: Bu prosedür kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır.
6. Karışımın santrifüjlenmesi
   1. Karışımı adım 1.5.1'den bir santrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 23.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
      DİKKAT: Santrifüjü çalıştırırken, her zaman eşit ağırlıkta tüpler yerleştirerek dengeyi koruyun.
7. GO / Cu nanokompozit karışımını 10 mL DI su ile yeniden süspanse edin ve çökeltinin çözelti boyunca eşit şekilde dağılmasını sağlamak için bunları sonikleştirin.
8. Çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 23.000 × g'da santrifüjleyin; Ardından süpernatanı çıkarın.
9. Reaksiyona girmemiş kimyasalları çıkarmak için 1.7-1.8 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
10. GO / Cu nanokompozitlerine 1 mL damıtılmış su ekleyin ve tortuyu sıvı faz boyunca eşit şekilde dağıtmak için karışımı sonikleştirin.
    NOT: Tüm GO / Cu nanokompozit çözeltilerini tek bir konik tüpte toplayın.
11. Çözeltiyi -60 °C'de GO / Cu nanokompozitler tamamen kuruyana ve GO / Cu nanokompozit tozu elde edene kadar gece boyunca bir vakum altında dondurarak kurutun.
12. GO / Cu nanokompozit tozunu kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.

2. Antibakteriyel test için bakterilerin hazırlanması

DİKKAT: Bu prosedür, alkol lambalı bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Bakteriyel atıklar bertaraf edilmeden önce otoklavlanmalıdır. Antibiyotiğe dirençli bakterilerle çalışırken eldiven, önlük ve maske giyilmeli ve deneyden sonra eller sabun veya el dezenfektanı kullanılarak yıkanmalıdır. Her zaman iyice dezenfekte edin; Deney alanında kontaminasyon meydana gelirse, derhal% 70 etanol ile dezenfekte edin.

1. Bakteri kültürü besiyeri hazırlama
   1. Bir şişede 20 g triptik soya agar ve 500 mL damıtılmış suyu karıştırın. Karışımı otoklavda 121 °C'de 15 dakika sterilize edin.
   2. Agar sertleşmeden önce 15 mL agar solüsyonunu bir Petri kabına dökerek agar plakasını hazırlayın. Agar plakasını kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu, agar çözeltisi sertleşmeden önce hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, sertleşme sırasında agar plakasını 15 dakika UV ile sterilize edin.
   3. 15 g triptik soya suyu (TSB) ve 500 mL damıtılmış suyu bir şişede karıştırın. Karışımı otoklavda 121 °C'de 15 dakika sterilize edin.
   4. 40-50 mL et suyu çözeltisini 50 mL'lik konik bir tüpe alın. Et suyunu kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kontaminasyonu önlemek için, aliquoted et suyunu 15 dakika UV ile sterilize edin.
2. Bakteri kültürü
   1. MSRA veya P. aeruginosa stok çözeltisini bir halka kullanarak agar plakasına aşılayın. Agar plakasını 37 °C'de çalkalanan bir inkübatör kullanarak 24 saat inkübe edin.
   2. Bir bakteri kolonisini bir halka kullanarak 10 mL et suyuna aşılayın. Et suyunu 24 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayan bir inkübatör kullanarak 37 °C'de inkübe edin.
   3. Aynı özelliklere sahip bakterileri elde etmek için 2.2.1-2.2.2 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
   4. 24 saat sonra, steril damıtılmış su kullanarak bakteri çözeltisini on kat seri olarak seyreltin. 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonunu agar plakasına aşılayın ve bir yayıcı ile yayın. Agar plakasını 37 °C'de çalkalanan bir inkübatör kullanarak 24 saat inkübe edin.
      NOT: Seyreltme seviyesi bakterilere bağlıdır. Bir agar plakasında 100'den az koloni hazırlamayı hedefleyin.
   5. Denklem (1)'i kullanarak koloni oluşturan birimi (CFU) belirlemek için 24 saatlik inkübasyondan sonra bakteri kolonilerini sayın.
      (1)
   6. Bakterilerin CFU'sunun nispeten sabit olup olmadığını doğrulamak için 2.2.4-2.2.5 adımlarını en az 3 kez tekrarlayın.

3. Mikrodilüsyon suyu yöntemini kullanan antibakteriyel test

1. 1. Gün) Bir bakteri kolonisini agar plakasından bir halka kullanarak 10 mL et suyuna aşılayın. Et suyunu 24 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayan bir inkübatör kullanarak 37 °C'de inkübe edin.
2. 2. Gün) GO / Cu nanokompozit karışımını Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) kullanarak en az üç konsantrasyonda hazırlayın. GO / Cu nanokompozit süspansiyonu, GO / Cu nanokompozitleri DPBS'de iyi dağılana kadar sonikleştirin.
   NOT: Bu protokolde 500, 250, 125 ve 62.5 μg/mL GO / Cu nanokompozit karışımı test edilmiştir.
3. Kontrol çözeltilerini hazırlayın. Negatif kontrol DPBS'dir ve pozitif kontrol, DPBS'de bakterileri öldürecek bir penisilin / streptomisin çözeltisinin% 1'idir.
4. 100 μL GO / Cu nanokompozit süspansiyonu ve kontrol çözeltilerini 96 oyuklu plakalara ekleyin. Tüm örnekleri üç nüsha halinde ekleyin.
   NOT: Numuneleri bakterilere uygulamadan önce 15 dakika UV ile sterilize edin.
5. 24 saatlik inkübasyondan sonra CFU'ya dayanarak, TSB kullanarak bakteriyel süspansiyonu 1 × 10⁶ CFU / mL'ye seyreltin.
   NOT: Çalışmamızdaki ilk MRSA ve P. aeruginosa kültür süspansiyon konsantrasyonları, adım 2.2.5'e göre, sırasıyla 4.5 × 10⁹ CFU / mL ve 3 × 10⁹ CFU / mL'dir. 1 × 10⁶ CFU/mL'lik bakteri konsantrasyonları, sırasıyla 4.500x ve 3.000x kültürlerinin seyreltilmesiyle elde edilir.
6. 1 × 10⁶ CFU / mL seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun 100 μL'sini 96 oyuklu plakalardaki numune kuyucuklarına aşılayın. 96 oyuklu plakaları 24 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayan bir inkübatör kullanarak 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Nihai bakteri konsantrasyonu, 100 μL numune ile karıştırıldıktan sonra 5 ×^{10 5} CFU/mL'dir.
7. 3. Gün) Numuneyi ve bakteri süspansiyonlarını 200 μL'lik bir mikropipet ucu ile kuvvetlice karıştırın. Numune-bakteri karışımını steril damıtılmış su ile on kat seri olarak seyreltin.
   NOT: Seyreltme seviyesi bakterilere bağlıdır. Bir agar plakasında 100'den az koloni hazırlamayı hedefleyin.
8. 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonunu agar plakasına aşılayın ve bir yayıcı ile yayın. Agar plakasını 37 °C'de çalkalanan bir inkübatör kullanarak 24 saat inkübe edin.
9. 4. Gün) Denklem (2)'yi kullanarak GO / Cu nanokompozitlerinin antibakteriyel aktivitesini doğrulamak için bakteri kolonilerini sayın ve CFU değerlerini belirleyin.
   (2)

Sonuçlar

GO / Cu nanokompozitlerinin oluşumunu doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDS) analizleri yapıldı. Şekil 1A,B, heterojen Cu nanopartiküllerinin GO tabakaları üzerinde büyütüldüğünü göstermektedir. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, EDS haritalaması, GO tabakasındaki parçacıkların Cu nano...

Tartışmalar

Burada, antibiyotiğe dirençli bakterileri yok etmek için potansiyel olarak etkili bir yöntem olacak olan Cu nanopartikülleri ile biriktirilen GO nano tabakalarını hazırlamak için düşük maliyetli ve basit bir yöntem sunuyoruz. GO / Cu nanokompozitlerinin sentezlenmesindeki kritik adım, çözelti içinde GO ve CuCl_2'yi iyice dağıtmak ve bunları karıştırırken yüksek bir sıcaklığın korunmasıdır. Ayrıca, redoks adımı hızlı bir şekilde gerçekleşti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Clinical MDR bacterial strains	Chung-Ang University Hospital (Seoul, South Korea)
Copper(II) chloride dihydrate	Duksan	10125-13-0
Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM)	Carl Zeiss	SIGMA
Graphene oxide	Sigma	796034
Sodium Borohydride	Sigma	71320
Transmission Electron Microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100
Tryptic Soy Agar	BD difco	236950
Tryptic Soy Broth	BD difco	211825