İğne açıklığı hakkında geri bildirim için sabit hava basıncı kullanan mikroenjeksiyon iğnelerinin ıslak eğimi

Özet

Bu protokol, iğne eğimi verme işlemi sırasında basınçlı havanın bir iğneye verilmesi için bir pnömatik sistemin montajını açıklar. Protokol ayrıca keskin mikroenjeksiyon iğneleri oluşturmak için eğim verme işlemini ve iğnenin nispi açıklık boyutunun nasıl ölçüleceğini açıklar.

Özet

Mikroenjeksiyon iğneleri, genom modifikasyon reaktiflerinin, CRISPR bileşenlerinin (kılavuz RNA'lar, Cas9 proteini ve donör şablonu) ve transpozon sistemi bileşenlerinin (plazmitler ve transpozaz mRNA) gelişmekte olan böcek embriyolarına verilmesinde kritik bir araçtır. Keskin mikroenjeksiyon iğneleri, bu modifiye edici ajanların verilmesi sırasında özellikle önemlidir, çünkü enjekte edilen embriyoya verilen zararı en aza indirmeye yardımcı olurlar, böylece eğimsiz iğnelerle enjeksiyona kıyasla bu embriyoların hayatta kalma oranını arttırırlar. Ayrıca, iğnelerin eğimi, iğne ucunu bir nesneye (lamel tarafı, enjekte edilecek embriyonun yüzeyi vb.) sürterek iğne ucunu rastgele kırarak açılan iğnelere kıyasla iğneden iğneye daha tutarlı iğneler üretir. Mikroenjeksiyon iğnelerinin iğneye verilen sabit basınçlı hava ile ıslak eğim verme işlemi, iğneyi eğim veren kişinin iğnenin ne zaman açık olduğunu (kabarcıkların varlığı) bilmesini sağlar ve ayrıca ne kadar büyük bir iğne açıklığının oluşturulduğuna dair göreceli bir gösterge verir. İğnedeki nispi açıklık boyutu, bir dengeye ulaşılana ve iğnenin ucundan kabarcıkların akması durana kadar iğneye verilen hava basıncının ayarlanmasıyla belirlenebilir. Dengeye ulaşılan basınç ne kadar düşükse, iğne boyutu o kadar büyük olur; Tersine, basınç ne kadar yüksek olursa, iğne boyutu o kadar küçük olur.

Giriş

Böcek genetik modifikasyonu, orijinal olarak Drosophila'da Rubin ve Spradling tarafından geliştirilen bir süreçtir ve yıllar içinde bu süreç, diğer türlerde genetik modifikasyonlar oluşturmak için modifiye edilmiştir¹. İşlem, gelişmekte olan embriyo ^2,3,4 içinde belirli bir zaman ve konum penceresinde embriyolara mikroenjekte edilen modifikasyon bileşenlerinin hassas bir şekilde verilmesine dayanır. Keskin mikroenjeksiyon iğneleri, sivrisinekler 4,5,6,7,8,9 ve kum sinekleri¹⁰ gibi bazı böceklerin genetik modifikasyonu sürecinde kritik bir araçtır, ancak ipekböcekleri gibi diğer böcekler için kritik değildir ¹¹. Keskin iğneler, genetiği değiştirilmiş bir böcek^yaratmaya çalışırken genellikle başarı ve başarısızlık arasında önemli bir faktördür ^2,4. Tipik olarak, mikrokılcal cam iğneler, camın elastik hale geldiği noktaya kadar camın ısıtılmasıyla çekilir ve kılcal damarın sivrilen kapalı uçlu bir iğneye çekilmesine izin verilir. İğne kullanılmadan önce, enjeksiyon için keskin bir uç oluşturacak şekilde açılması gerekir. Geleneksel olarak iğneler, iğne ucunun uçtan az miktarda camın kopmasına neden olan bir şeye (bir sürgün/lamel kenarı veya embriyo vb.) hafifçe fırçalanarak açılır ve rastgele keskin bir uç oluşturulur ^2,3. Biraz daha az rastgele bir işlem, iğnenin kısa bir süre için optik olarak düz, dönen bir aşındırıcı plakaya hızlı bir şekilde indirildiği ve iğne ucundan az miktarda camın aşınmasına neden olarak keskin bir uç oluşturduğu kuru eğim vermedir. Kuru eğim verme, iğne ucunu bir şeye sürtmekten biraz daha az rastgeledir. Aşağıda açıklanan protokol, eğim verilen iğneye basınçlı hava sağlayarak ve iğne açılır açılmaz kabarcıkların görünür olması için sıvı bir tabaka altında eğim vererek eğim verme işlemini bir adım daha ileri götürür. Bu protokol, güvenilir derecede keskin mikroenjeksiyon iğneleri üretmek için bir yöntemi detaylandırır. Sıvı bir tabaka altında eğim verme, yukarıda açıklandığı gibi iğneyi rastgele kırmaya ve kuru eğim vermeye göre bir gelişmedir, çünkü kullanıcı eğim verme işlemi hakkında geri bildirim alır ve eğim veren kişinin iğnenin ne zaman açık olduğunu ve iğne açıklığının nispeten ne kadar büyük olduğunu bilmesini sağlar. İğne ucunun göreceli açılma boyutunun bilinmesi, eğim veren kişinin farklı açıklık boyutlarına sahip iğneler oluşturmasına izin verebilir. Çeşitli iğne açma boyutlarının farklı avantajları vardır; Örneğin, daha büyük iğne açma boyutları, yüksek viskoziteli enjeksiyon karışımlarını barındırabilirken, daha küçük açma iğneleri enjekte edilen embriyoya daha az zarar verir.

Hava, bir regülatör ve modifiye edilmiş hava basıncı ayarlı enjeksiyon sistemine dayalı bir üretan boru sistemi kullanılarak iğneye^{verilir 2}. İğneye sabit bir basınçta hava verilirken, iğne bir sıvı tabakası altında eğim verilir. Kaynak ağzı açma işlemi, tekrarlanan beş aşamalı bir işlemden oluşur: 1) iğneyi aşındırıcı yüzeye indirmek, 2) iğnenin kısa bir süre için eğim vermesine izin vermek, 3) iğneyi sıvı tabakanın yüzeyinin altında tutarken aşındırıcı plakadan uzaklaştırmak, 4) kabarcıkların görünümünü kontrol etmek için aşındırıcı plakanın dönüşünü durdurmak. Kabarcık yoksa, kabarcıklar görünene kadar 1'den 4'e kadar olan adımlar tekrarlanır; 5) Kabarcıklar mevcut olduğunda, iğnenin nispi açıklık boyutunu belirlemek için hava basıncı ayarlanabilir. Kabarcık oluşumunu durdurmak için gereken basınç ne kadar düşükse, iğne ucundaki açıklık o kadar büyük olur.

Protokol

NOT: Aşağıda açıklanan protokol, eğimli Sutter BV-10 mikrokılcal damar kullanır. Bununla birlikte, bu protokol, herhangi bir model mikrokılcal eğimli ile kullanım için değiştirilebilir.

1. Regülatör, basınç göstergesi ve hava besleme borusunun montajı

1. Hava beslemesinden regülatörün tabanına bağlantı için üretan borunun bir bölümünü kesin ( R ; Bölüm 1, Şekil 1). Bu bölümün uzunluğu, hava beslemesinden beveler'in yanında yer alacak olan regülatöre olan mesafeye bağlı olacaktır.
2. Bir hortum kelepçesini üretan borunun üzerine kaydırın, ardından bir hortum konektörünü borunun ucuna itin. Hortum konektörünü sert bir yüzeye yerleştirerek hortum bağlantısının tam olarak takıldığından emin olun. Boruyu hortum bağlantısına yakın tutarken, hortum bağlantısı tam olarak takılana kadar boruyu hortumun içine sıkıca bastırın. Hortum kelepçesi ve hortum bağlantısı birlikte HC bağlantısını oluşturur (Şekil 1).
3. Hortum kelepçesini, hortum bağlantısının takılı olduğu borunun ucuna kadar kaydırın. Hortum kelepçesini, hava geçirmez bir bağlantı oluşturacak şekilde takılan diken ucunun üzerine döndürün.
4. Hortum konektörünü regülatörün (R) tabanına elle vidalayın, ardından bağlantıyı küçük bir anahtarla sıkmayı bitirin. Bağlantının hava geçirmez olduğundan ancak aşırı sıkı olmadığından emin olun.
5. Regülatörün yan bağlantı noktasında, bir T konektörünü (T) elle vidalayın, ardından sıkma işlemini tamamlamak için küçük bir anahtar kullanın.
6. Yaklaşık 3-5 cm uzunluğunda küçük bir parça üretan boru kesin (Şekil 1, Bölüm 2). Boru parçasına iki hortum kelepçesi yerleştirin, ardından borunun her iki ucuna bir hortum konektörü takın ve borunun her iki ucu için 1.2-1.4 adımlarında açıklandığı gibi bağlantıları (HC) bitirin.
7. Kısa borunun bir ucunu manometrenin tabanına vidalayın, ardından adım 1.5'teki gibi bir anahtarla sıkma işlemini bitirin.
8. Kısa borunun diğer ucunu, adım 1.5'te regülatöre bağlı T konektörü (T) üzerindeki bağlantı noktalarından birine vidalayın.
9. Regülatör ve iğne tutucu (NH) arasındaki bağlantı için üretan borunun bir bölümünü (Şekil 1, Bölüm 3) kesin. Bu bölümün boyutu, beveler ile regülatörün bulunduğu yere olan mesafeye bağlı olacaktır.
10. Boru bölümüne bir hortum kelepçesi yerleştirin, ardından 1.2-1.4 adımlarında açıklandığı gibi bir hortum konektörü takın.
11. Borunun bu bölümünün diğer tarafına, iğne tutucu (NH) ile birlikte verilen dişi luer konektörünü (LC) yerleştirin.
12. Tutma kelepçesini ve naylon rondelayı (Şekil 2, f) manipülatörden çıkarın. Tespit kelepçesi ve rondela, yalnızca bir cam mikro kılcal damarı tutmak için tasarlanmıştır, bir mikro kılcal tutucunun, dişli çubuğun ve hava besleme borusunun ek ağırlığını taşımak üzere tasarlanmamıştır.
13. Dişli çubuğu bisiklet çamurluk kelepçesine sarmak için 1,5 cm x 2 cm boyutlarında dikdörtgen bir lastik ambalaj tabakası kesin. Bu, dişli çubuğu ve iğne tutucuyu bisiklet çamurluk kelepçesinde daha güvenli bir şekilde tutmaya yardımcı olacaktır. İki iğne burunlu pense kullanarak, bisiklet çamurluk klipsini açın, dikdörtgen lastik salmastra parçasını, çubuğun bir ucundan 3.5 cm dişli çubuğun üzerine, çubuk üzerinde bir U oluşturacak şekilde katlayın. Kauçuk levha kaplı dişli çubuğu açılan bisiklet çamurluğuna yerleştirinamp ve pense cl'yi kapatmak için cl'yi kullanınamp çubuk ve lastik levha etrafında. Bisiklet kelepçesini ve dişli çubuk tertibatını manipülatör cıvatasına takın, tespit kelepçesini naylon rondela olmadan değiştirin ve tutma kelepçesini dişli çubuk tertibatını güvenli bir şekilde tutana kadar sıkın.
14. İğne tutucuyu dişli çubuğa geçirin. Luer konektörünün, bağlandığında üretan boruyu bağlamayacak bir konumda bittiğinden emin olun (Şekil 2, g).
15. Dişi luer konektörünü iğne tutucunun (Şekil 2, d) erkek luer konektörüne (Şekil 2, g) bağlayın.
16. Şekil 1, Bölüm 1 tüpünün serbest ucunu hava kaynağına bağlayın (bu bağlantı kullanılan hava kaynağına göre değişecektir). Hava beslemesi temiz, kuru hava olmalı ve yağ kalıntısı içermemelidir. Hava beslemesi, bir ev hava kaynağından veya gaz silindirinden, basınçlı hava veya Nitrojenden olabilir.

2. Eğimli borosilikat iğneleri

1. Borosilikat cam mikro kılcal damarlar kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerini cihaz üzerinde aşağıdaki ayarlarla çekin: Isı: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, Döngü süresi 12.24.
2. Taşlama tertibatını, aşındırıcı plaka ve mıknatıslı tutma halkasından oluşan üreticinin talimatlarına göre^{monte edin 12}.
   NOT: Photo-Flo'nun (ıslatıcı madde) aşındırıcı plakadan erken sızmasını önlemek için aşındırıcı plakanın ince bir şeffaf film şeridi ile sarılması gerekebilir. Bu, yalnızca ıslatıcı madde çözeltisi kaide yağına zamanından önce sızar ve taşlama plakasının dönmesini durdurursa gereklidir. Islatıcı madde, eğim verme işleminden sonra cam iğneler üzerinde kuruma izleri oluşma riskini azaltır. Bir ıslatma maddesinin kullanılması, pahlama işlemi için kritik değildir ve su ikame edilebilir.
3. Kaidenin optik olarak düz yüzeyine 10 damla kaide yağı damlatın ve taşlama tertibatını üstüne yerleştirin. Taşlama tertibatını başlatın.
4. Yüzeyi aydınlatmak için ışık kaynağını açın. Işık kaynağının eğimin arkasına yerleştirildiğinden ve aşındırıcı plaka ve iğneye 45°'lik bir açıyla parladığından emin olun. Aydınlatma açısı, iğnenin gölgesinin kolayca görülebilmesi için gereklidir. 90x büyütmede mikroskop kafasını yerine döndürün. Aşındırıcı plakanın dönmesini kısa bir süre durdurun ve mikroskobu aşındırıcı plakanın yüzeyine odaklayın.
5. Fitil tamamen ıslanana kadar fitile %1 ıslatıcı ekleyin. Aşındırıcı plakanın yüzeyine %1 ıslatıcı madde ekleyin. Islatıcı maddenin aşındırıcı yüzeyi kapladığından, ancak siyah tutma halkasına sızmadığından emin olun.
6. Ön ıslak fitili, dönerken aşındırıcı plakanın yüzeyine yerleştirin. Fitilin aşındırıcı plakanın sol tarafında olduğundan (yukarıdan aşağıya bakarken) ve saat 11 ile saat 6 arasında (plaka saat yüzü olarak olacak şekilde) uzandığından emin olun. Fitilin tutma halkasının siyah kısmına binmediğinden emin olun.
7. İğne tutucuya bir iğne sokun (Şekil 2, d) ve iğneyi yerinde tutmak için tutma halkasını sıkın. Regülatörü açın (Şekil 1, R) ve basıncı 24 psi'ye yükseltin.
8. Rota ayar düğmesini çevirerek iğne tutucuyu kaldırın (Şekil 2, a) İğnenin, dönen aşındırıcı plakanın yüzeyinden daha yüksek olacak kadar yükseğe kaldırıldığından emin olun, ardından tüm manipülatörü, iğne dönen aşındırıcı plakanın üzerinde yerine dönecek şekilde döndürün. Pahlanacak iğne, plakanın dönüşü iğnenin ucundan uzaklaşacak şekilde yönlendirilecek şekilde dönen aşındırıcı plaka üzerine yerleştirilmelidir (Şekil 3A)
9. Yandan izlerken, iğneyi aşındırıcı plaka yüzeyine doğru indirmek için kaba ayar düğmesini (Şekil 2, a) kullanın. İğne sıvının yüzeyine neredeyse temas ettiğinde durun.
10. Mikroskobun büyütme oranını düşürmek için yakınlaştırmayı kullanın, ardından mikroskobu, iğne görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin. Görüş merkezine girdikten sonra, manipülatörün konumunu iğne ucu görüş merkezinde kalacak şekilde ayarlayarak büyütmeyi artırın. Maksimum büyütmeye ulaştıktan sonra, taşlama plakasını durdurun ve mikroskobu aşındırıcı plakanın yüzeyine odaklayın, ardından yüzey odaklandığında plakanın dönüşünü hemen yeniden başlatın. İğne bu noktada görünmeyebilir.
11. Manipülatör kaba ayar düğmesini kullanarak iğneyi aşındırıcı plakaya doğru indirin. Görüş alanında, iğnenin bir görüntüsü ve iğnenin bir gölgesi/gölgeleri görünecektir. İğne ve iğnenin gölge(ler)i dokunmaya yakın olduğunda, manipülatör ince ayar düğmesine geçin ve iğne ve gölge(ler)i birbirine değiyormuş gibi görünene kadar iğneyi indirmeye devam edin. Bu noktada, kumpası okuyun (Şekil 2, c) ve okumayı not edin. Aşındırıcı plakanın yüzeyi bu kaliper okumasında veya altındadır.
    NOT: İğnenin dönen aşındırıcı plakanın yüzeyine ne zaman temas ettiğini görmek zordur, bu nedenle iğne bu noktada aslında aşındırıcı plakaya dokunmuyor olabilir.
12. İğnenin 5-10 saniye boyunca bu kaliper okuma seviyesinde kalmasına izin verin.
13. Manipülatör ince ayar düğmesini kullanarak iğneyi kaldırın ve ıslatıcı maddenin yüzeyinin altında kaldığından emin olun. Aşındırıcı plakanın dönüşünü birkaç saniye durdurun ve iğne ucundan kabarcıkların çıkıp çıkmadığını gözlemleyin. Baloncuklar varsa, adım 2.15'e geçin. Baloncuklar yoksa, adım 2.14'e geçin.
14. Manipülatör ince ayar düğmesini kullanarak iğneyi kaliper okumasına geri getirin, ardından biraz aşağı hareket ettirin ve yeni bir kumpas okuması yapın, ardından 2.12-2.13 adımlarını tekrarlayın.
15. Plaka dönerken kabarcık oluşumunun gözlemlenip gözlemlenmediğini görmek için aşındırıcı plakayı tekrar başlatın. Plaka dönüşü sırasında kabarcık oluşumuna dair kanıtlar görülüyorsa, iğne ucunun açıklığı, sivrisinek embriyo enjeksiyonları gibi hassas embriyo mikroenjeksiyonları için muhtemelen çok büyüktür. Aşındırıcı plaka dönüşü sırasında kabarcık oluşumu görünmüyorsa, iğne açıklığı keskin ve küçük bir açma iğnesi gerektiren prosedürlerde kullanım için idealdir.
16. İğneyi aşındırıcı plakanın üzerinde, iğneyi aşındırıcı plakadan ve mikroskoptan uzaklaştırmak için tüm manipülatör döndürülürken iğnenin hiçbir şeye çarpmayacağı kadar yüksek bir konuma kaldırmak için manipülatör rota ayar düğmesini kullanın.
17. İğne hiçbir şeye çarpmadan çıkarılabilecek bir konuma geldiğinde, hava basıncını sıfıra düşürün, iğneyi çıkarın ve bir iğne saklama kutusuna (eğimli iğneleri tutmak için çift çubuklu bant veya modelleme kili olan bir Petri kabı) yerleştirin.

3. Eğimli iğnenin nispi açıklık boyutunun belirlenmesi

NOT: Eğimli iğnenin bağıl açıklık boyutlarının belirlenmesi adım 2.13'te yapılmıştır. Aşağıdaki adımlarda bu işlem daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

1. Adım 2.13'te kabarcıklar gözlemlendiğinde, aşındırıcı plaka dönmüyorken, regülatör ayar düğmesini (Şekil 1, R) iğnenin ucundan kabarcıkların akması durana kadar çevirerek hava basıncını yavaşça azaltın. Kabarcıkların uçtan akmayı durdurduğu basınca dikkat edin.
2. İğne ucundan tekrar kabarcıklar akana kadar hava basıncını artırın. Basınç ne kadar yüksek olursa, iğnenin açıklığı o kadar küçük olur.
3. İğneyi güvenli bir şekilde çıkarılabileceği bir konuma getirerek devam edin, 2.16-2.17 adımları.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedür, tutarlı bir şekilde keskin mikroenjeksiyon iğneleri üretir. Keskin iğneler, sivrisinek embriyoları gibi yumuşak koryon böcek embriyolarına, embriyo zarından çok az dirençle veya hiç direnç göstermeden yerleştirilebilmesi ile karakterize edilir. Sivrisinek embriyoları genetik modifikasyon için mikroenjekte edildiğinde, embriyo zarı nispeten elastiktir. Kör bir iğneyi embriyo zarına doğru itmek, embriyonun girintili olmasına neden o...

Tartışmalar

Sivrisineklerin genetik modifikasyonu, modifikasyon materyallerinin (plazmitler, kılavuz RNA'lar veya proteinler) blastoderm öncesi embriyolara 3,4,5,6,7,8 hassas mikroenjeksiyonuna dayanır. Bu işlem için çok önemli olan, enjeksiyon ^2,4

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050