JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Özet

Çoğu in vitro model, gerçek yaşam ortamlarında gözlemlenen karmaşık etkileşimlerden ortaya çıkan bakteri fenotiplerini tam olarak araştırma kapasitesinden yoksundur. Bu, özellikle çok organlı bir genetik hastalık olan kistik fibroz (KF) ile yaşayan bireylerin hava yollarında tespit edilen tedavisi zor, kronik ve polimikrobiyal biyofilm bazlı enfeksiyonlar bağlamında geçerlidir. Birden fazla mikrobiyom çalışması, KF'li (pwCF) kişilerin hava yolunda tespit edilen mikrobiyal bileşimleri tanımlamış olsa da, şimdiye kadar hiçbir in vitro model, KF ile ilgili kritik akciğer özelliklerini tam olarak entegre etmemiştir. Bu nedenle, karışık tür KF akciğer enfeksiyonlarının patogenezini yönlendiren mekanizmaları araştırma kapasitesinde önemli bir bilgi boşluğu bulunmaktadır. Burada, CF benzeri koşullarda yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis ve Prevotella melaninogenica dahil olmak üzere yakın zamanda geliştirilen dört türlü bir mikrobiyal topluluk modelini tanımlıyoruz. Bu sistemin kullanılmasıyla, çeşitli patojenlerin antimikrobiyal inatçılığı gibi klinik olarak anlamlı fenotipler gözlendi ve moleküler düzeyde araştırıldı. Bu in vitro modelin kullanışlılığı, kronik KF akciğer enfeksiyonları bağlamında türler arası etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırabilen standartlaştırılmış iş akışında yatmaktadır.

Giriş

Çok organlı genetik bir hastalık olan kistik fibroz (KF) hava yolunda tespit edilenler gibi hastalığa neden olan mikropları ortadan kaldırmayı amaçlayan stratejiler genellikle başarısız olur1. Yani, mukus açısından zengin KF akciğer ortamında büyüyen esnek biyofilm benzeri mikrobiyal toplulukların varlığı, birkaç on yıla yayılan kronik enfeksiyonlara neden olabilir2. Ayrıca, ön hat antimikrobiyallerinin (Abx) ve modülatörlerin kullanımı KF'li hastalarda (pwCF) daha iyi sonuçlarla sonuçlanmış olsa da, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus gibi kanonik KF patojenlerine karşı tipik olarak kullanılan "bir böcek, bir enfeksiyon" klinik yaklaşımı, bu bireylerin akciğerlerinde tespit edilen tedavisi zor enfeksiyonların çözümünde etkisiz kalmıştır 3,4, 5,6,7.

Son yirmi yılda, çok sayıda çalışma kronik KF akciğer hastalığı hakkındaki anlayışımızı değiştirmiştir8. Diğer bir deyişle, raporlar, pwCF'nin hava yollarında tespit edilen enfeksiyonların yalnızca tek bir patojenden kaynaklanmadığını, doğası gereği polimikrobiyal olduğunu göstermektedir8. Ayrıca, karışık tür KF akciğer enfeksiyonlarının patogenezi hala tam olarak anlaşılamamış olsa da, klinik kanıtlar, hava yollarında hem S. aureus hem de P. aeruginosa ile birlikte enfekte olan pwCF'nin, bu iki patojenden herhangi biri tarafından kolonize edilen bireylere göre akciğer fonksiyonlarını kötüleştirdiğini göstermektedir9.

KF patojenleri arasındaki türler arası etkileşimlerin, polimikrobiyal biyofilm bazlı enfeksiyonların KF terapötiklerinin kullanımı yoluyla kolayca ortadan kaldırılamamasının ve sonuçta hasta sonuçlarını etkilemesinin bir nedeni olduğu varsayılmaktadır3. Bunu destekleyen in vitro çalışmalar, P. aeruginosa, S. aureus ve diğerleri gibi mikroplar arasındaki etkileşimlerin, vankomisin ve tobramisin 6,10,11 dahil olmak üzere ön saflardaki KF ilaçlarına Abx yanıtı gibi klinik olarak anlamlı fenotipleri etkileyebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, karışık tür enfeksiyonları bağlamında KF patojenlerini ortadan kaldırmayı amaçlayan mevcut tedavi stratejilerinin yeniden gözden geçirilmesi gerekmektedir.

Mikrobiyal bazlı KF akciğer enfeksiyonlarının yönetiminde altın standart, klinik müdahalelere rehberlik etmek için büyük ölçüde antimikrobiyal duyarlılık testinin (AST) kullanılmasına dayanır12. Bununla birlikte, AST tipik olarak, CF hava yolunda 3,13 tespit edilen mikrobiyal büyüme koşullarını yansıtmayan, zengin ve iyi karıştırılmış kültürlerde yetiştirilen bakteriyel monokültürler kullanılarak yapılır. Hasta sonuçları ile tedavi başarısı arasındaki önemli kopukluk göz önüne alındığında, klinik raporlar artık KF akciğerinin kritik özelliklerini entegre eden yeni yaklaşımların geliştirilmesini savunmaktadır12,14.

İkiden fazla patojen içeren in vitro sistemlerde KF ile ilgili bakteriyel çoklu türler geliştirilmiş az sayıda çalışmavardır 15,16. Bununla birlikte, bu modeller (1) KF akciğerinin polimikrobiyal ve biyofilm benzeri doğasını tam olarak yansıtmaz ve (2) KF hava yolunda tespit edilenlere yakın beslenme ve çevresel koşulları kullanmaz15,16. Büyük CF-akciğerden türetilen 16S rRNA gen veri setlerinin madenciliği ve hesaplaması yoluyla, Jean-Pierre ve meslektaşları yakın zamanda yukarıda belirtilen özellikleri10 entegre eden bir in vitro ko-kültür modeli geliştirdiler. Bu sistem P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ve Prevotella spp. KF hava yolu benzeri koşullarda yetiştirilir ve 14 güne kadar stabildir. Yazarlar ayrıca Prevotella spp.'nin topluma özgü büyümesini ve bu KF patojenlerinin Abx duyarlılığında tanımlanması gereken mekanizmalar yoluyla birkaç değişiklik olduğunu bildirmişlerdir10. Bu izlenebilir in vitro sistem ayrıca, pwCF10'un hava yollarında sıklıkla tespit edilen yaygın bir P. aeruginosa varyantının Abx inatçılığı ile ilgili mekanik odaklı soruları araştırma imkanı da sundu. Bu nedenle, bu protokolün amacı, KF ile ilgili bir dizi sorunun üstesinden gelmek için daha da genişletilme potansiyeline sahip bir in vitro biyofilm büyütmek için KF araştırma topluluğuna standartlaştırılmış bir deneysel iş akışı sağlamaktır.

Protokol

Tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yapay balgam ortamının hazırlanması

NOT: Bu protokol boyunca, yapay balgam ortamı (ASM), daha önce Turner ve meslektaşları17 tarafından yayınlanan SCFM2'den modifiye edilmiş CF ile ilgili ortam olarak tanımlanır. Aşağıda, bu ortamı hazırlama adımlarının bir açıklaması bulunmaktadır. Stok çözümleri ve saklama koşulları yapmak için Malzeme Tablosuna bakın. ASM'nin bu versiyonu Turner ve ark.,17'den farklıdır, çünkü orijinal versiyondaki tamponlama kapasitesi zaman içinde stabil bir pH'a izin vermez. Yani, Streptococcus spp. ve Prevotella spp. gibi anaeroblar tarafından gerçekleştirilen fermantasyon aktivitesi, büyüme ortamının asitleşmesine neden olur (yayınlanmamış gözlemler). Bu nedenle, 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) konsantrasyonu 10 mM'den 100 mM'ye ayarlanmıştır.

NOT: 2x ASM baz (ASMb) stok çözeltisinin hazırlanması, ASM10,18'de bulunan moleküllerin nihai konsantrasyonunu etkilemeden müsin, agar, su vb. bileşenlerin eklenmesini kolaylaştırır. 2x ASMb önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de karanlık bir yerde iki haftaya kadar saklanabilir. Ortam sararırsa, atın.

  1. 2x ASM baz stoğunu hazırlamak için, 400 mL diH2O içeren temiz bir beherde, karıştırırken aşağıdakileri ekleyin:
    1. 6.50 mL 0.2 M NaH2PO4 ekleyin. H2O stoku; 0,2 M Na2HPO4 stoğunun 6,25 mL'si; 348 μL 1 M KNO3 stoğu; 1.084 mL 0.25 M K2SO4 stoğu.
    2. Triptofan içermeyen 4.0 g Maya sentetik damla ekleyin; 3.032 g NaCl; 20.92 g MOPS; 1.116 g KCl ve 0.124 gNH4Cl.
    3. 1 M L-Laktik asit stoğundan 9.30 mL ekleyin; 2.70 mL 1.1 M glikoz stoğu; 1.75 mL 1 M CaCl2.2H 2O stoğu; 1.20 mL 0.25 M N-asetilglukozamin stoğu ve 1.00 mL 3.6 mM FeSO 4.7H 2Ostoğu.
    4. 660 μL 0,1 M Triptofan stoğu ekleyin; 606 μL 1 M MgCl2.6H 2O stoğu; ringa balığı sperminden 0.60 g deoksiribonükleik asit; 400 μL 250 mg / mL 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) stoğu.
    5. Tüm bileşenler eklendikten sonra, 5 M NaOH stoğu ile pH'ı 6,80'e ayarlayın. 0,22 μm'lik bir filtre kullanaraksterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  2. 10 mg / mL (2x) müsin stoğu hazırlamak için, 250 mL diH2O içeren temiz bir cam şişe kullanın ve karıştırırken:
    1. Domuz midesinden 5.0 g müsin ekleyin - Tip II. Süspansiyonu 10 dakika karıştırın. diH2O ile 500 mL'ye kadar tamamlayın.
    2. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. Kullanılana kadar 4 °C'de tutun.
  3. ASM'yi yeniden oluşturun.
    NOT: Bu adımın deneyin yapıldığı gün gerçekleştirilmesi gerekir.
    1. 2x ASMb stoğu ve 10 mg / mL müsin stoğunun 1: 1 hacim oranını karıştırın.
    2. Kullanmadan önce iyice girdaplayın.

2. Polimikrobiyal topluluk seçici besiyerlerinin hazırlanması

NOT: Aşağıda, 1 L hacimde bir ortam hazırlamak için gerekli miktarlar verilmiştir.

  1. Mannitol Salt Agar (MSA) ve Pseudomonas İzolasyon Agar'ı (PIA) hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin.
  2. Prevotella Selective Agar'ı (PSA) hazırlamak için temiz bir cam şişede aşağıdakileri ekleyin:
    1. 30.0 g triptik soya suyu (TSB). 15.0 g agar. 5.00 g Maya özütü. 0.50 g L-sistein hidroklorür.
    2. 10.0 mL 0.5 mg / mL hemin stoğu. 100 μL 10 mg / mL menadion stoğu.
    3. 940 mL diH2O ekleyin ve karıştırın. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
    4. Soğuduğunda (yani şişe çıplak elle tutulabilir), karıştırırken ekleyin: 50.0 mL dökülmüş koyun kanı. 50 mg / mL kanamisin stoğunun 2.00 mL'si. 150 μL 50 mg / mL vankomisin stoğu. 500 μL 10 mg / mL polimiksin B stoğu.
  3. Streptococcus Selective Agar'ı (SSA) hazırlamak için temiz bir cam şişede aşağıdakileri ekleyin:
    1. 30.0 g TSB. 15.0 g agar.
    2. 950 mL diH2O ekleyin ve karıştırın. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
    3. Soğuduğunda (yani şişe çıplak elle tutulabilir), karıştırırken ekleyin: 50.0 mL dökülmüş koyun kanı. 1.00 mL 10 mg / mL polimiksin B stoğu. 1.00 mL 10 mg / mL oksolinik asit stoğu.
      NOT: Plakalara dökün ve en fazla 1 ay boyunca 4 ° C'de tutun. Kullanmadan önce, plakaları aşılanmadan önce 24 saate kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın. PSA, P. melaninogenica ve Prevotella intermedia ile doğrulanmıştır. SSA, S. sanguinis ve Streptococcus milleri grubu (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius ve Streptococcus anginosus, SMG olarak gösterilir) ile doğrulanmıştır. Yeni suşlar test edilecekse, bu seçici ortamların de novo doğrulanması şiddetle tavsiye edilir.

3. Bakteriyel sıvı besiyeri hazırlama ve üreme koşulları

  1. P. aeruginosa ve S. aureus'u rutin olarak büyütmek için steril zengin bir ortam kullanın (örneğin, lizojeni suyu (LB) veya TSB).
    1. Daha önce 37 ° C'de 20-24 saat boyunca bir LB / TSB agar plakasında yetiştirilen tek bir koloniyi seçerek sıvı gecelemeye başlayın.
    2. Et suyu kültürlerini gece boyunca 37 °C'de 250 rpm'de 16-18 saat çalkalayarak büyütün.
  2. Streptococcus spp.'yi yetiştirmek için, %0,5 maya özü (THB-YE) ile takviye edilmiş steril Todd Hewitt Suyu kullanın.
    1. 37 ° C +% 5 CO2'de 24 saat boyunca% 5 defibrine koyun kanı (kan agar plakası) ile desteklenmiş bir TSB agar plakasında daha önce yetiştirilen tek bir koloniden gece boyunca sıvı kültüre başlayın.
    2. THB-YE kültürlerini anaerobik olarak veya 37 °C +% 5 CO'da büyütün2 gece boyunca 18-22 saat çalkalamadan pişirin.
  3. Prevotella spp.'yi büyütmek için, temiz bir şişeye aşağıdakileri ekleyerek 1 L Prevotella büyüme ortamı (PGM) hazırlayın:
    1. 30.0 g TSB. 5.00 g maya özütü. 0.50 g L-sistein hidroklorür. 10.0 mL 0.5 mg / mL hemin stoğu ve 100 μL 10 mg / mL menadion stoğu.
    2. 990 mL diH2O ekleyin 121 ° C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. Şişeyi ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
    3. Prevotella spp. kolonileri, 37 ° C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edilmiş bir kan agar plakası üzerinde.
    4. Tek bir koloniyi PGM'de aşılayın ve 24 saat boyunca anaerobik olarak 37 ° C'de sallanmadan gece boyunca büyütün.
      NOT: PGM, oda sıcaklığında iki haftaya kadar saklanabilir. Kullanımdan önce her bir büyüme ortamı üzerinde sterilite testlerinin yapılması şiddetle tavsiye edilir. Anaerobik bir oda kullanılmıyorsa, Prevotella spp.'nin sıvı gecelerini başlatmak gerekebilir.

4. Ko-kültür deneyi hazırlama

NOT: Şekil 1'de özetlenmiş bir deneysel iş akışı gösterilmektedir. Deneyin kurulması, hazırlık süresinin 1 saatten az sürmesi durumunda oksik koşullarda yapılabilir. Bundan daha uzun sürmesi bekleniyorsa, deneyin anaerobik bir oda (% 10 CO2,% 10 H2 ve% 80 N2 karışık gaz ile) kullanılarak yapılması şiddetle tavsiye edilir. Deney numunelerini inkübe etmek için anaerobik kavanozlar da kullanılabilir.

  1. Monokültürlerin ve kokültürlerin hazırlanması
    NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 10.000 x g'da gerçekleştirin. Ko-kültürler için, 96 oyuklu plakaları aşılamadan hemen önce bakteri örneklerini karıştırın. Tipik olarak, gece boyunca kültürlerden P. aeruginosa ve S. aureus suşları için 1 mL'lik bir hacim toplanır. Streptococcus spp. ve Prevotella spp. için gece hacimleri 2-4 mL arasında değişebilir. Bu hacimler, test edilecek koşul sayısına bağlı olarak ayarlanabilir.
    1. Gece boyunca kültürlerden elde edilen bakteri sıvısını kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
      1. P. aeruginosa ve S. aureus suşları için, steril fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak iki kez yıkayın.
      2. Streptococcus spp. ve Prevotella spp. için steril PBS ile bir kez yıkayın.
        NOT: Peletler kolayca kaybolabileceğinden, süpernatantları dikkatlice atmak için bir pipet kullanın.
      3. Yıkamalardan sonra, her peleti 1 mL 1x suyla seyreltilmiş ASMb içinde yeniden süspanse edin.
      4. Steril PBS'de her numuneyi 1:10 oranında seyreltin ve OD600'ü ölçün.
      5. ASM'de tüm kültürleri 0,2'lik bir OD600'e ayarlayın.
      6. OD600 = 0.2 süspansiyonlarını kullanarak, bakteri örneklerini ASM'de monokültürler ve ko-kültürler için 0.01'lik son bir OD600'e (her mikrop için) seyreltin.
      7. 5 saniye boyunca iyice girdaplayın.
        NOT: Örneğin, OD600 = 0.01'de toplam 1 mL P. aeruginosa monokültür ASM süspansiyonu hazırlamak için, OD600 = 0.2'de 50 μL P. aeruginosa 950 μL ASM hacmine ekleyin. Ko-kültür için, her bir P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ve Prevotella spp. OD600 = 0.2'de süspansiyonlar ve 800 μL ASM'ye ekleyin.
      8. Bir pipet kullanarak, steril plastik düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı kuyucuğuna 100 μl monokültür ve ko-kültür süspansiyonları ekleyin.
      9. Plakayı (çalkalamadan) anoksik koşullarda 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
        NOT: Diğer oksijen gerilimleri (örn. mikroxia, normoksi) burada da kullanılabilir. Bununla birlikte, model anoksik koşullarla geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Mono ve ko-kültür bakteri süspansiyonlarını seri olarak seyrelterek başlangıç aşılamasını onaylayın ve PIA, MSA, SSA ve PSA üzerine kaplama yapılması şiddetle tavsiye edilir. Her bakteri türü için hedeflenen başlangıç konsantrasyonu 1 × 107 CFU/mL (P. aeruginosa), 3.5 × 106 CFU/mL (S. aureus), 1.2 × 106 CFU/mL (Streptococcus spp.) ve 4.6 ×10 6 CFU/mL'dir (Prevotella spp.). Bakteriyel inokul, Jean-Pierre ve meslektaşları10 tarafından tanımlandığı gibi de değiştirilebilir.
  2. Biyofilm oluşumundan sonra ortamı değiştirin.
    1. 24 saatlik inkübasyondan sonra, bağlanmamış (planktonik) hücreleri çok kanallı bir pipet kullanarak aspirasyon ile çıkarın.
    2. Önceden oluşturulmuş biyofilmleri 100 μL taze ASM veya istenen tedavi (örn. antibiyotikler, metabolitler, vb.) ile doldurun.
    3. Plakayı anoksik koşullarda 37 ° C'de 24 saat daha inkübe edin.
      NOT: Bu adımlar hızlı bir şekilde gerçekleştirilirse (yani 1 dakikadan daha kısa bir sürede) aerobik olarak yapılabilir. Aksi takdirde, lütfen anaerobik bir oda kullanın.

5. Numunelerin toplanması ve kaplanması

  1. Ek 24 saatlik inkübasyondan sonra, bağlı olmayan (planktonik) hücreleri çok kanallı bir pipetle aspire edin.
    NOT: Planktonik fraksiyon tutulabilir, seri olarak seyreltilebilir ve seçici ortam üzerine kaplanabilir veya atılabilir.
  2. Biyofilmleri 125 μL steril PBS kullanarak iki kez nazikçe yıkayın ve hacimleri atın.
  3. 50 μL steril PBS ekleyin ve 96 pinli bir çoğaltıcı kullanarak hücreleri plakadan nazikçe kazıyarak biyofilmleri ayırın.
  4. Yeniden süspanse edilmiş biyofilm hücrelerini yeni bir steril 96 oyuklu plakanın A sırasına aktarın.
    NOT: 96 oyuklu plaka, B'den H'ye kadar olan sıralarda steril PBS içerecektir.
  5. Planktonik (gerekirse) ve biyofilm fraksiyonlarının 10x seri seyreltmesini gerçekleştirin.
  6. Her seyreltme örneğinden 3-5 μL'yi PIA, MSA, SSA ve PSA üzerine yerleştirin.
  7. Aşılama noktalarının kurumasını bekleyin.

6. Seçici plakaların ve koloni oluşturma birimi (CFU) sayımının inkübe edilmesi

  1. P. aeruginosa ve S. aureus için 37 °C'de 18-20 saat inkübe edin.
  2. Streptococcus spp için, 37 °C'de anoksik koşullarda 24 saat inkübe edin.
  3. Prevotella spp için, 37 ° C'de anoksik koşullarda 48 saat inkübe edin.
  4. Kuluçkadan sonra, kolonileri sayın (nokta başına ~ 10-35) ve mL başına CFU'yu hesaplayın.
  5. Bir görselleştirme aracı kullanarak verileri çizin.

Sonuçlar

Şekil 2'de gösterildiği gibi, (1) monokültüre kıyasla karışık bir planktonik topluluklar yetiştirildiğinde P. aeruginosa ve S. aureus canlı hücre sayılarının sayısında bir azalma, (2) S. sanguinis hücrelerinin polimikrobiyal büyümesinde bir artış ve (3) Jean-Pierre ve meslektaşları10 tarafından daha önce bildirildiği gibi P. melaninogenica'nın karışık topluluk büyüm...

Tartışmalar

Klinik olarak bilgilendirilmiş bu in vitro ko-kültür sisteminin kullanışlılığı, polimikrobiyal spesifik bakteri fonksiyonlarını tespit etme kapasitesinde yatmaktadır. Yani, bu modelin kullanılmasıyla, Prevotella spp.'nin topluma özgü büyümesinden (Şekil 2), P. aeruginosa, S. aureus ve S. sanguinis'in ön hat CF Abx'ine duyarlılıktaki değişikliklere kadar değişen mikrobiyal fenotipler bildi...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir açıklama beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Dr. George A. O'Toole ve Dr. Thomas H. Hampton'a in vitro polimikrobiyal topluluk modelinin tasarımı ve geliştirilmesindeki önemli rolleri için teşekkür ederiz. El yazması hakkındaki yararlı yorumları için Dr. Sophie Robitaille'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kistik Fibrozis Vakfı'nın FJP'ye JEAN21F0 bir hibe ile desteklenmiştir. El yazmasının Şekil 1'i BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)SigmaM1254Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lidFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular JarFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's bloodTo prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigmaD7290Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
KanamycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Lactic acid SigmaL1750Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-TryptophanSigmaT0254Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Prepare using manufacturer's recommendations.
MenadioneSigmaM5625Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II SigmaM2378Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4ClFisher ScientificA661-500Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acidPrepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin BPrepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy BrothFisher ScientificDF0370-17-3Prepare using manufacturer's recommendations.
VancomycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast ExtractFisher ScientificB11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan SigmaY1876Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.

Referanslar

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317 (2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996 (2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258 (2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604 (2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423 (2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031 (2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822 (2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123 (2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479 (2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kistik FibrozisPolimikrobiyal BiyofilmBakteriyel Fenotiplern Vitro ModellerMikrobiyal Topluluk ModeliPseudomonas AeruginosaStaphylococcus AureusStreptococcus SanguinisPrevotella MelaninogenicaKF Akci er EnfeksiyonlarAntimikrobiyal nat l kT rler Aras Etkile imlerKronik Enfeksiyonlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır