PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Özet

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

Özet

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir süreçtir. Protokol, hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenosin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturur. ATP ile kombine LPS, genellikle piroptozu incelemek için kullanılan klasik bir inflamatuar indüksiyon yöntemidir, ancak apoptoz ve nekrotoz da LPS / ATP ile stimülasyona yanıt verir. Normal şartlar altında, fosfatidilserin sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken aşamalarında, hücre zarı bozulmadan kalır ve fosfatidilserine maruz kalır ve sonraki aşamalarda hücre zarı bütünlüğünü kaybeder. Burada, tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-Aminoaktinomisin D (AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, LPS / ATP ile stimülasyondan sonra önemli hücrelerin öldüğünü göstermektedir. Taramalı elektron mikroskobu kullanarak, tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemliyoruz. Sonuçlar, hücrelerin LPS / ATP ile stimülasyondan sonra piroptoz, apoptoz veya nekrotoz geçirebileceğini göstermektedir. Bu protokol, LPS/ATP ile stimülasyondan sonra makrofajların ölümünü gözlemlemeye odaklanır. Sonuçlar, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün piroptoz ile sınırlı olmadığını ve apoptoz ve nekrotik apoptozun da meydana gelebileceğini gösterdi, bu da araştırmacıların LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünü daha iyi anlamalarına ve daha iyi bir deneysel yöntem seçmelerine yardımcı oldu.

Giriş

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir fizyolojik süreçtir. Son yıllarda, önemli çalışmalar, hücre ölümünün organizma içindeki bağışıklık ve dengede rol oynadığını göstermiştir. Hücre ölümünü incelemek, hastalıkların başlangıcını ve gelişimini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Programlanmış hücre ölümünün çeşitli biçimleri tanımlanmış ve bu süreçlerdeki bazı kilit hedefler tanımlanmıştır. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotoz, iç denge ve hastalık^1'de yer alan genetik olarak tanımlanmış üç programlanmış hücre ölümü yoludur.

Piraktoz, zar gözeneklerinin oluşumu ve hücre içeriğinin salınması ile karakterizedir. Aktive edilmiş kaspazlar veya granzimler, daha sonra oligomerleşen, zara bağlanan ve gözenekleri ^2,3,4 oluşturan N-terminal alanlarını ayırmak için gasderminleri parçalar. Gasdermin gözeneği, hücresel zarlar boyunca atipik bir salgı kanalı sağlar, bu da içerik salınımı ve iyon akışı ^2,3,4 dahil olmak üzere aşağı akış hücre tepkilerine neden olur. Sonuçta, hücreler sonunda ninjurin-1⁵ tarafından kolaylaştırılan plazma zarı yırtılması ve piroptotik lizis yaşarlar. Apoptozda, aktive edilmiş Bax ve Bak, mitokondriyal dış zar üzerinde oligomerler oluşturur ve BCL-2 ailesinin proapoptotik ve antiapoptotik proteinleri, başlatıcı kaspazlar (kaspaz-8, -9 ve -10) ve efektör kaspazlar (kaspaz-3, -6 ve -7) arasındaki denge ile düzenlenen sitokrom C'yi serbest ^{bırakır1,6,7}. Apoptozun morfolojik değişiklikleri arasında membran kanaması, hücre büzülmesi, nükleer parçalanma, kromatin yoğunlaşması ve apoptotik cisim oluşumu^{bulunur 6,8}. Reseptör etkileşimli serin / treonin-protein kinaz 1 (RIPK3) ve karışık soy kinaz alanı benzeri (MLKL), nekrototik mekanizma^1'in iki aşağı akış çekirdek bileşenidir. RIPK3 MLKL'yi işe alır ve fosforile eder, p-MLKL oligomerize eder, hücre zarı ile birleşir, zar deliklerini başlatır, iyon akışına neden olur, hücre içi ozmolariteyi arttırır ve sonunda hücre yırtılması ^6,9. Gasdermins ve MLKL plazma zarına bağlanır ve sırasıyla piroptoz ve nekrotoza aracılık ederken, BAX/BAK mitokondri^6'nın dış zarına bağlanarak apoptoza aracılık eder.

Her yolun kendine özgü mekanizmaları ve sonuçları olmasına rağmen, hücre zarında benzer değişikliklere yol açarlar. Normal şartlar altında, fosfatidilserin (PS) sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS plazma zarının dışında açığa çıkacaktır. Kaspaz-3 / kaspaz-7, asimetrik bir hücre zarına yol açan ve apoptoz¹⁰ sırasında PS'yi dışsallaştıran TMEM16 ve XKR ailelerini aktive eder. Gasdermin D aracılı ve MLKL aracılı Ca^{2 +} akışı, hücre zarı üzerindeki fosfolipid çift tabakasının simetrisinin kaybına ve PS'nin maruz kalmasına yol açar. Maruziyet, hücre zarı bütünlüğünün kaybından önce gerçekleşir^11,12. Bu üç tip programlanmış hücre ölümünün zarındaki benzer değişikliklere dayanarak, hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V / 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz. Kalsiyuma bağımlı bir fosfolipid bağlayıcı protein olan Annexin V, plazma zarının¹³ yüzeyinde açıkta kalan PS'yi tespit etmek için hassas bir prob görevi görebilen PS için yüksek bir afiniteye sahiptir. 7-AAD, tüm hücre zarından geçemeyen bir nükleik asit lekesidir. Yaygın olarak kullanılan bir nükleik asit boyası olan propidyum iyodür (PI) ile benzerdir. Benzer floresan özelliklerine sahiptirler, ancak 7-AAD daha dar bir emisyon spektrumuna ve diğer algılama kanallarıyla daha az parazite sahiptir. Bu benzerlikler nedeniyle piroptoz, apoptoz ve nekrotoz arasında ayrım yapmak yeterli değildir. Tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için akış sitometrisi kullandık. Tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak hücre zarını yakalamak için ikinci bir yöntem kullanılır.

Hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenozin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturduk. Bu protokol, mekanizmaları araştırmaktan ziyade hücre ölümünü gözlemlemeye odaklanır.

Protokol

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

1. İnsan monositik hücre hattı THP-1'i% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 mM β-merkaptoetanol ile RPMI-1640 tam kültür ortamında büyütün. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş havada kültürleyin. Her 2-3 günde bir alt kültür hücreleri.
   NOT: THP-1 bir süspansiyon hücresidir, alt kültür için ortamın yarısını değiştirmeyi seçin. Işık mikroskobu altında birçok hücre parçasını gözlemlerken, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Önceden ısıtılmış taze tam hücre kültürü ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.
2. Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasında hücreleri (4-10. bölümlerde) kullanın. Hücreler iyi durumda ve logaritmik büyüme evresinde olduklarında, 100 x'te ışık mikroskobu altında yuvarlak, parlak, yoğun ve kümeler ve hücre parçaları içermezler.

2. THP-1 hücrelerinin farklılaşması

1. 1 mM konsantrasyonda bir PMA stok çözeltisi hazırlayın (1 mg PMA'yı 1.62 mL dimetil sülfoksit içinde çözün). PMA stok çözeltisini şununla seyreltin:tam hücre kültürü ortamı 100 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna kadar.
2. Kültür kabındaki hücreleri 10 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, hücreleri PMA içeren 3 mL tam kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.
3. Hücre sayacını ve sayma yazılımını açın. Hücre sayaç kartına 20 μL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücre sayaç kartına yerleştirin. Önizleme B1'e tıklayın, enstrümanın sağ alt kısmındaki düğmeyi çevirin ve hücrelerin yazılımda net konturlara sahip parlak merkeze sahip olmasını sağlamak için odak mesafesini ayarlayın. Saymaya başlamak için Sayım'a tıklayın.
4. Sayım sonuçlarına dayanarak, bir hücre yoğunluğunu 1 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlamak için PMA içeren tam kültür ortamı kullanın. 6 oyuklu bir plakadaki tohum hücreleri, daha fazla tedaviye başlamadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO₂ 'de 24 saat inkübe edin.

3. THP-1 hücrelerinin tedavisi

1. 1 mg / mL konsantrasyonda bir LPS stok çözeltisi hazırlayın (1 mg LPS'yi 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün). LPS stok çözeltisini serumsuz ortamla 1 μg/mL'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin. 500 mM konsantrasyonda bir Na₂ATP stok çözeltisi hazırlayın (0.3026 g ATP'yi 1 mL PBS içinde çözün).
2. PMA içeren ortamı kuyulardan aspire edin ve PBS 1x ile yıkayın. Kontrol grubuna serumsuz besiyerini ve model grubuna LPS içeren serumsuz besiyerini ekleyin. Daha fazla işleme devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO₂ 'de 6 saat inkübe edin.
3. 6 saat sonra, ATP stok çözeltisini model grubuna 500 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna ekleyin. Devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO_2'de 45 dakika inkübe edin.

4. Akış sitometrisi analizi (Yöntem 1)

1. Deney örneklerinin hazırlanması
   1. Hücreleri adım 2'ye göre 6 oyuklu plakalarda tohumlayın ve inkübe edin. Tedavi edilmeyen dört kontrol grubu oluşturun: bir leke yok kontrolü, iki tek boyama kontrolü (her leke için bir tane) ve bir çift boyama kontrolü. Bir tedavi grubu oluşturun ve 3. adıma göre tedavi edin.
   2. Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve PBS 2x ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.
   3. Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   4. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL PBS ekleyin. Hücreli tüpleri 37 °C'de 3 dakika boyunca bir su banyosuna yerleştirin. Tüm numuneleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   5. 200 μL 5x bağlama tamponunu 800 μL damıtılmış su ile 1x bağlama tamponuna seyreltin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 100 μL 1x bağlayıcı tampon ekleyin ve hücreleri 5 mL'lik tüpe aktarın.
   6. 10 dakika boyunca bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ve 5 dakika boyunca başka bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin (ayrı ayrı tek boyama kontrolleri olarak). Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.
   7. Kalan tüplere 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. 5 dakika sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.
   8. 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerin bir parçası olan 35 μm'lik bir naylon ağ kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve test için bekleyin. Test etmeden önce yavaşça karıştırın ve ardından cihaza yerleştirin.
2. Akış sitometrisi
   1. Test için floresanla etkinleştirilen hücre sıralama akış sitometresi kullanın. Akış sitometresi veri analiz yazılımını açın ve dedektörün ve lazerin performansını onaylayın. Sitometreye tıklayın ve Fluidics başlatmayı seçin, sistemin hazır olmasını bekleyin. Sitometre > Temizleme Modları > Gaz Giderme Akış hücresine tıklayarak akış odası kabarcıklarını hariç tutun.
   2. Deney'e tıklayın, sırayla Yeni klasör, Deney, Numune, Tüp ve Adı Düzenle'yi seçin. Tüpün önündeki beşgen şekilli bir ok, yandığında yeşile döner.
   3. Sitometre FACSCelesta (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın, Parametre'yi seçin ve ardından FSC, SSC ve PE sinyalini seçin. PE histogramını oluşturmak için Global Çalışma Sayfası (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi için, 586 nm'de Annexin V için PE kullanın ve X ekseni üzerinde çizin; 700 nm'de 7-AAD için PerCP-Cy5.5 ve Y ekseni üzerinde çizim.
   4. Lekesiz kontrol örneğini yerleştirin.ampönce cihaza yerleştirin. Edinme Panosu simgesine (bir kısayol tuşu simgesi) tıklayın, istenen popülasyondan en az 10.000 olay alın. FSC-A ve SSC-A nokta grafiğinde bir geçit (P1) kullanarak kalıntıları hariç tutun. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin. Hücre popülasyonunu FSC/SSC histogramının köşegenine yerleştirmek için voltajı ayarlayın ve Yeniden Başlat'a tıklayın. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin.
   5. Sonraki tüpe tıklayın, telafiyi ayarlamak için Annexin V ve 7-AAD'nin tek boyama kontrollerini çalıştırın. Kalan tüpleri çalıştırın ve veri toplayın.

5. SEM görüntüleme (Yöntem 2)

1. Deney örneklerinin hazırlanması
   1. Hücreleri 6 oyuklu plakalarda 2. adıma göre tohumlayın ve inkübe edin ve 3. adıma göre muamele edin.
   2. Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve 2x'i PBS ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.
   3. Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   4. Hücreleri 500 μL elektron mikroskobu fiksatifi (%2,5 glutarik dialdehit, 100 mM fosfor tuzları) ile oda sıcaklığında 2 saat sabitleyin, ardından gece boyunca 4 °C'de bekletin.
   5. Krom şap çözeltisi hazırlayın: 100 mL ultra saf suya, 70 °C su banyosu ısıtmasına 1.0 g jelatin ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. 0,05 g krom şap ekleyin, eşit şekilde karıştırın ve filtre kağıdı ile süzün. Temiz kapak camını 37 °C'de 2 saat krom şap çözeltisine batırın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C fırında kurutun.
      NOT: Amaç, deney sırasında hücre ayrılmasını önlemektir.
   6. Hücreleri sabit çözeltiden toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. 100 μL PBS ekleyin ve hücreleri nazikçe üfleyin. Hücre süspansiyonunu kapak camına bırakın, 5 dakika bekletin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.
      NOT: Hücre ayrılmasını önlemek için işlem nazikçe yapılmalıdır. Kuvvetlice sallamayın, yavaş hareket etmeyin ve duvar boyunca yavaşça sıvı ekleyin.
   7. 1 saat boyunca 500 μL% 1 osmik asit fiksasyonu ekleyin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.
   8. Numuneleri, EtOH çözeltisi başına 15 dakika boyunca bir dizi etanol (EtOH) konsantrasyonunda (%30, %50, %70, %80, %90, %95, %100, %100) art arda dehidre edin.
      NOT: Kapak camları 4 ° C'de birkaç gün boyunca% 100 EtOH içinde tutulabilir, ancak aşırı dehidrasyonu önlemek için mümkün olan en kısa sürede kurumalıdır.
   9. Kritik nokta kurutucuyu açın, CO₂ tankını açın, hazneyi 10 °C'ye soğutun. Hazne basıncı 0 psi olduğunda numuneyi hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile sarın ve hazneye koyun.
   10. Giriş vanasını açın, CO₂ gözlem penceresinden gözlemleyin, iki kırmızı çizgi arasındaki sıvı CO₂ seviyesini yükseltin (Üst limiti aşmayın), giriş vanasını kapatın. Numuneyi 10 dakika bekletin. CO_2'yi 1 dakika eşitlemek için giriş ve egzoz valflerini aynı anda açın (sıvı CO₂ , EtOH'nin yerini alır). Sıvı CO₂ seviyesini belirtilen konuma yükseltmek için egzoz valfini kapatın, giriş valfini kapatın.
   11. Sıcaklığı 35 °C'ye ve basıncı 1250 psi'ye ayarlayın. Sıcaklık ve basınç dengelendiğinde, 100 psi/dk'da basıncı boşaltın. Hazne basıncı sıfır olduğunda numuneyi çıkarın ve cihazı kapatın.
   12. İletken bant kullanarak numuneleri SEM alüminyum numune tutuculara monte edin. Numuneleri bir altın tabakası (2-5 nm) ile kaplamak için bir püskürtme kaplayıcı kullanın.
2. Görüntüleme
   1. Görüntüleme için yüksek çözünürlüklü soğuk alan emisyon SEM kullanın. SEM'in hızlanma voltajını 3 kV'a ayarlayın. Çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın. Panoramayı gözlemlemek için büyütmeyi 1.000x'e ayarlayın. Plazma zarını bulmak ve numuneyi görüntülemek için büyütmeyi 5.000x ve 20.000x olarak ayarlayın.
      NOT: PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarını SEM yoluyla görselleştirme işlemi, diğer hücre ve doku türlerine benzer ve kullanılan aletlere bağlıdır. Referans¹⁴ , eşlik eden videolarla birlikte ayrıntılı bir SEM protokolü sağlar.

Sonuçlar

Hücre örnekleri protokolde tarif edildiği gibi tedavi edildi ve akım sitometrisi tespiti yapıldı. Normal hücreler Annexin V ve 7-AAD (Annexin V- / 7-AAD-) ile boyanamaz. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS maruz kaldı ve Annexin V'e bağlandı, ancak hücre zarı hala sağlamdı ve hücre dışı boşluktan 7-AAD hariç tutuldu (Annexin V + / 7-AAD-). Daha sonraki aşamalarda, hücre zarı bütünlüğünü kaybeder, hücreler aynı anda Annexin V ve 7-AAD ile boyanır ve çift pozitif sonuçlar...

Tartışmalar

Bu yazıda, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümünü saptamak için iki yöntem kullanılmıştır. Annexin V/7-AAD çift boyama kullanıldı ve sonuçlar genel boyamadan akış sitometrisi ile analiz edildi. Diğer akış sitometrik analizlerinde olduğu gibi, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçları dışlamak için bir grup boyanmamış hücre ve iki grup tek boyanmış hücre kuruldu. Sonuçlar, LPS / ATP stimülasyonundan sonra, birkaç hücrenin zar bütünlüğün?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1