Bitki Tarafından Üretilen Rekombinant Proteinin Saflığını Artırmak için Apoplast-Ekstraksiyon Bazlı Yöntem

Özet

Bitki sistemlerinden rekombinant proteinlerin saflaştırılması genellikle bitki proteinleri tarafından sorgulanır. Bu çalışma, Nicotiana benthamiana'nın apoplastından salgılanan bir rekombinant proteini etkili bir şekilde ekstrakte etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sağlar.

Özet

Bitkiler, terapötik proteinler üretmek için araştırılan yeni gelişen bir ökaryotik ekspresyon sistemidir. Bitkilerden rekombinant proteinlerin saflaştırılması, üretim sürecindeki en kritik adımlardan biridir. Tipik olarak, proteinler toplam çözünür proteinlerden (TSP) saflaştırıldı ve çeşitli hücre içi proteinlerin ve sitokromların varlığı, sonraki protein saflaştırma adımları için zorluklar doğurur. Ayrıca, antijenler ve antikorlar gibi terapötik proteinlerin çoğu, uygun glikozilasyon elde etmek için salgılanır ve tam olarak değiştirilmemiş proteinlerin varlığı, tutarsız antijen veya antikor yapılarına yol açar. Bu çalışma, bitki apoplastik alanından yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant proteinler elde etmek için daha etkili bir yöntem sunmaktadır. Rekombinant Yeşil floresan proteini (GFP), Nicotiana benthamiana'nın apoplastına salgılanmak üzere tasarlanmıştır ve daha sonra bir infiltrasyon-santrifüjleme yöntemi kullanılarak ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen apoplasttan elde edilen GFP-His daha sonra nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılır. TSP'nin geleneksel yöntemlerinin aksine, apoplasttan saflaştırma, yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant proteinler üretir. Bu, bitki üretim sistemleri için önemli bir teknolojik gelişmeyi temsil eder.

Giriş

Günümüzde, antikorlar, aşılar, biyoaktif proteinler, enzimler ve küçük polipeptitler 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere bitki tarafından üretilen çeşitli rekombinant terapötik proteinler incelenmektedir. Bitkiler, güvenlikleri, düşük maliyetleri ve üretimi hızlı bir şekilde ölçeklendirme yetenekleri nedeniyle terapötik proteinler üretmek için giderek daha fazla kullanılan bir platform haline gelmektedir ^7,8. Bitki siste....

Protokol

1. N. benthamiana bitkilerinin hazırlanması

1. Fide bloklarını bir tepsiye koyun, 1 L su ekleyin ve tamamen dolana kadar yaklaşık 2 saat bekletin.
2. Fide bloklarının üzerine eşit şekilde yabani tip N. benthamiana tohumlarını serpin, bir kapakla örtün ve 1 hafta boyunca çimleyin. N. benthamiana'yı 18 saat fotoperiyodu, 24 °C, %45 bağıl nemi olan bir serada yetiştirin ve her 2 haftada bir gübreleyin.
3. Tohumlar filizlendikten sonra, köklerine zarar vermemeye dikkat ederek bir fideyi nazikçe çıkarmak için cımbız kullanın. Yeni bir tepsinin ortasına küçük bir çukur kazın,....

Tartışmalar

Terapötik proteinler üretmek için bitkilerin kullanılması son yıllarda hızla genişledi 1,2,3,4,5,6. Protein kodlayan genler, ekspresyon vektörlerine klonlanır ve agroinfiltrasyon yoluyla bitki dokularına verilir. Bitki hücreleri tarafından üretildikten sonra, proteinler sonraki uygulamalar için saflaştırılı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer