Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

Özet

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Özet

Ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae , onlarca yıldır mitokondriyal biyolojiyi anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu model, ökaryotlar arasındaki temel, korunmuş mitokondriyal yollar ve mantarlar veya mayaya özgü yollar hakkında bilgi sağlamıştır. S. cerevisiae'nin birçok yeteneğinden biri, şimdiye kadar sadece S. cerevisiae ve tek hücreli algler Chlamydomonas reinhardtii'de mümkün olan mitokondriyal genomu manipüle etme kapasitesidir. Maya mitokondrisinin biyolistik dönüşümü, bölgeye yönelik mutasyonları tanıtmamıza, gen yeniden düzenlemeleri yapmamıza ve muhabirleri tanıtmamıza olanak tanır. Bu yaklaşımlar esas olarak mitokondrideki yüksek derecede koordineli iki sürecin mekanizmalarını anlamak için kullanılır: mitoribozomlar tarafından translasyon ve solunum komplekslerinin ve ATP sentazın montajı. Bununla birlikte, mitokondriyal dönüşüm potansiyel olarak diğer yolları incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada, maya mitokondrisinin yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile nasıl dönüştürüleceğini, amaçlanan dönüştürücünün nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genomda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını gösteriyoruz.

Giriş

Saccharomyces cerevisiae mayası, mitokondriyal biyogenezi incelemek için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir modeldir. Maya anaerobik, fakültatif bir organizma olduğundan, solunumu bozan mutasyonların ortaya çıkmasının nedenlerini ve sonuçlarını kapsamlı bir şekilde incelemek mümkündür. Ek olarak, bu organizma mitokondriyal yolları incelemek için dost genetik ve biyokimyasal araçlara sahiptir. Bununla birlikte, solunum kompleksi montajı ve mitokondriyal protein sentezi mekanizmalarını keşfetmek için en güçlü kaynaklardan biri, mitokondriyi dönüştürme ve organelin genomunu değiştirme yeteneğidir. Daha önce, mitokondriyal DNA (mtDNA) nokta mutasyonları veya k....

Protokol

NOT: Mitokondriyal dönüşüm verimliliği genellikle düşük olduğu için her yapı için altı dönüşüm yapmanızı öneririz. Farklı büyüme ortamlarının bileşimi Tablo 2'de gösterilmektedir.

1. Tungsten parçacık hazırlama

1. Bir mikrotüpte 30 mg 0.7 μm tungsten parçacıkları (WP'ler, mikro taşıyıcılar) tartın. Sterilize etmek için 1,5 mL %70 etanol (EtOH) ekleyin. WP'leri vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin.
2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.200 x g'da santrifüjleyin. WP'leri partiküllere 1,5 mL steril su ekleyerek, girdaplayarak ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.....

Tartışmalar

Bu çalışma, S. cerevisiae mayasından mitokondrinin nasıl başarılı bir şekilde dönüştürüleceğini açıklamıştır. Yüksek hızlı mikromermi bombardımanından amaçlanan maya suşunun saflaştırılmasına kadar olan süreç, sentetik ^rho-suşun kaç tur saflaştırılmasının gerekli olduğuna bağlı olarak ~ 8-12 hafta sürer. Yöntemin kritik adımlarından bazıları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, mitokondriyal gen yapısındaki mutasyon bölgesinin etrafına eklenen yan bö.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920