Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Özet

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri temas bölgeleri,^Ca2+ ve lipid homeostazının düzenlenmesi, mitokondriyal dinamikler, otofagozom ve mitofagozom biyogenezi ve apoptoz gibi hücre sağlığı ve homeostazda kritik bir rol oynar. Normal ER-mitokondriyal eşleşmenin sürdürülememesi, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve kalıtsal spastik parapleji gibi birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynar. ER-mitokondriyal temasların düzensizliğinin hücre ölümüne nasıl yol açabileceğini ve bu temasların normal seviyeye onarılmasının nörodejeneratif durumları iyileştirip iyileştiremeyeceğini araştırmak büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu temasların seviyesini ölçen gelişmiş tahliller, bu hastalıkların patojenik mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Sonuç olarak, basit ve güvenilir tahlillerin oluşturulması, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Burada, canlı hücrelerdeki ER-mitokondri temaslarının seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir bölünmüş lusiferaz testini açıklıyoruz. Bu test, bu temasların patofizyolojik rolünü incelemek ve yüksek verimli taramada modülatörlerini tanımlamak için kullanılabilir.

Giriş

ER ve mitokondri arasındaki etkileşimler hücresel homeostaz ve sağkalım için hayati önem taşır 1,2,3,4. Önceki kanıtlar, ER-mitokondri temas bölgelerindeki herhangi bir bozulma veya düzensizliğin çeşitli nörodejeneratif, metabolik ve kardiyovasküler hastalıkların yanı sıra kansere katkıda bulunabileceğini göstermektedir 5,6,7,8,9,10.

Protokol

1. Hücre bakımı ve tohumlama (1. Gün)

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile (100 mm kültür kaplarında) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren hücre kültürü ortamındaki hücre kültürü ortamındaki HEK293T hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde_koruyun.
2. Başlamadan önce, mikroskop altında görüntüleyerek plakanın birleşip birleşmediğini kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkararak ve 10 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayarak hücreleri 6 oyuklu bir kültür plakasında tohumlamaya hazırlanın.
3. DPBS....

Tartışmalar

ER-mitokondri eşleşmelerinin seviyesini ölçmek için bir bölünmüş Renilla lusiferaz 8 yeniden birleştirme testi (split-Rluc testi) kullandık. Bu çalışmada, tek bir vektör, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry üreterek, her bir split-Rluc bileşenini kodlayarak orijinal split-Rluc yapısını²⁴ değiştirdik (MitoRluc^N ve Rluc^CER) .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C