JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, omurilik yaralanması onarımı için adipoz kaynaklı kök hücrelerin pro-rejeneratif davranışını araştırmak ve bunlardan yararlanmak için kullanılabilecek sinir-mimetik kompozit hidrojeller geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir.

Özet

Travmatik omurilik yaralanması (SKY), yaralanma bölgesinin altında kalıcı sensorimotor defisite neden olur. ABD'de yaklaşık çeyrek milyon insanı etkiliyor ve ölçülemez bir halk sağlığı sorununu temsil ediyor. Etkili tedavi sağlamak için araştırmalar yapılmıştır; bununla birlikte, yaralanma bölgesinin karmaşık doğası nedeniyle SCI hala tedavi edilemez olarak kabul edilmektedir. İlaç dağıtımı, hücre nakli ve enjekte edilebilir biyomalzemeler dahil olmak üzere çeşitli stratejiler araştırılmıştır, ancak tek başına bir strateji rejenerasyon için etkinliklerini sınırlar. Bu nedenle, son zamanlarda yaralanmanın çok yönlü özelliklerini hedef alabilen kombinatoryal tedaviler dikkat çekmiştir. Hücre dışı matrislerin (ECM) SCI için hücre transplantasyonunun etkinliğini artırabileceği gösterilmiştir. Bu amaçla, hücreden arındırılmış omurilikler (dSC'ler) ve siyatik sinirlerden (dSN'ler) oluşan 3 boyutlu hidrojeller farklı oranlarda geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir. dSC'lerin ve dSN'lerin histolojik analizi, hücresel ve nükleer bileşenlerin çıkarıldığını doğruladı ve hücresellikten çıkarmadan sonra doğal doku mimarileri korundu. Daha sonra, farklı hacimsel oranlarda kompozit hidrojeller oluşturuldu ve bulanıklık jelleşme kinetiği, mekanik özellikler ve gömülü insan yağ kaynaklı kök hücre (hASC) canlılığı analizlerine tabi tutuldu. Hidrojellerin ve hücresellikten arındırılmış omurilik matrislerinin farklı oranları arasında mekanik özelliklerde önemli bir fark bulunmadı. Jellere gömülü insan ASC'leri, 14 günlük kültür boyunca canlı kaldı. Bu çalışma, sinire özgü ECM ve pro-rejeneratif mezenkimal kök hücreler sunan doku mühendisliği kombinatoryal hidrojellerin üretilmesi için bir araç sağlar. Bu platform, gelecekteki araştırmalarla SCI'den sonra nöro-rejeneratif stratejiler hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.

Giriş

Yaklaşık 296.000 kişi travmatik SCI'den muzdariptir ve her yıl ABD'de yaklaşık 18.000 yeni SCI vakası meydana gelmektedir1. Travmatik SCI genellikle düşmeler, ateşli silah yaralanmaları, araç kazaları ve spor aktivitelerinden kaynaklanır ve sıklıkla yaralanma bölgesinin altında kalıcı sensorimotor fonksiyon kaybına neden olur. SCI tedavisi için tahmini yaşam boyu masraflar, önemli ölçüde daha düşük yaşam beklentileri ile kişi başına bir ila beş milyon dolar arasında değişmektedir1. Yine de, SKY hala tam olarak anlaşılamamıştır ve esas olarak yaralanma sonrası karmaşık patofizyolojik sonuçlar nedeniyle büyük ölçüde tedavi edilemez2. Hücre nakli ve biyomalzeme bazlı iskeleler dahil olmak üzere çeşitli stratejiler araştırılmıştır. Hücrelerin ve biyomateryallerin transplantasyonu potansiyel göstermiş olsa da, SCI'nin çok yönlü doğası kombinatoryal yaklaşımların daha faydalı olabileceğini düşündürmektedir3. Sonuç olarak, birçok kombinatoryal strateji araştırılmış ve tek tek bileşenlerden daha iyi terapötik etkinlik gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin ve ilaçların verilmesi için yeni biyomateryaller sağlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır3.

Doğal hidrojellerin üretilmesi için umut verici bir yaklaşım, doku hücreden arındırmadır. Hücreden arındırma işlemi, ECM bileşenlerini korurken hücresel ve nükleik materyallerin tümünü veya çoğunu çıkarmak için iyonik, iyonik olmayan, fiziksel ve kombinatoryal yöntemler kullanır. Hücresel bileşenlerin tamamını veya çoğunu çıkararak, ECM'den türetilen hidrojeller, implantasyon/enjeksiyondan sonra konakçıya karşı daha az immünoreaktiftir4. Hücreden arındırılmış dokuların kalitesini değerlendirmek için ölçülmesi gereken birkaç parametre vardır: hücresel/nükleik içeriğin çıkarılması, mekanik özellikler ve ECM'nin korunması. Olumsuz bağışıklık tepkilerini önlemek için aşağıdaki kriterler belirlenmiştir: 1) mg ECM kuru ağırlığı başına 50 ng'den az çift sarmallı DNA (dsDNA), 2) 200 bp'den az DNA fragmanı uzunluğu ve 3) 4'6-diamidino-2-fenuylindol (DAPI) ile boyanmış neredeyse hiç görünür nükleer materyal yoktur5. Mekanik özellikler çekme, kompresyon ve/veya reoloji testleri ile ölçülebilir ve orijinal dokuyabenzer olmalıdır 6. Ek olarak, protein koruması, örneğin laminin, glikozaminoglikan (GAG) ve omurilikiçin kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) gibi hücreden arındırılmış dokuların ana bileşenlerine odaklanan proteomik veya kantitatif deneylerle değerlendirilebilir 7,8. Doğrulanmış ECM'den türetilmiş hidrojeller, hücre bazlı tedaviye yardımcı olmak için farklı hücre türleri ile yeniden hücreselleştirilebilir9.

SCI onarımı için Schwann hücreleri, koku alma kılıf hücreleri, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ve nöral kök / progenitör hücreler gibi çeşitli hücre tipleri incelenmiştir 10,11,12. Ancak etik kaygılar, komşu hücre/dokularla seyrek entegrasyon, yüksek verim için doku kaynaklarının eksikliği, kendini yenileyememe ve/veya sınırlı proliferatif kapasite nedeniyle bu hücrelerin klinik kullanımı sınırlıdır 13,14,15. Bu hücre tiplerinden farklı olarak, insan adipoz kaynaklı MSC'ler (hASC'ler), lipoaspiratlar kullanılarak minimal invaziv bir şekilde kolayca izole edildikleri ve çok sayıda hücre elde edilebildikleri için çekici bir adaydır16. Ek olarak, hASC'ler nöroprotektif, anjiyogenistik, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve immünosupresyon potansiyeline sahip büyüme faktörleri ve sitokinleri salgılama yeteneğine sahiptir 17,18,19,20,21.

Tanımlandığı gibi, çok sayıda çalışma yapılmıştır 22,23,24 ve bunlardan çok şey öğrenilmiştir, ancak SCI'nin heterojen özellikleri fonksiyonel iyileşmeyi teşvik etmedeki etkinliklerini sınırlamıştır. Bu nedenle, SKY için tedavi etkinliğini artırmak için kombinatoryal yaklaşımlar önerilmiştir. Bu çalışmada, üç boyutlu (3D) bir hASC kültürü için hücreden arındırılmış omurilikler ve siyatik sinirler birleştirilerek kompozit hidrojeller geliştirilmiştir. Başarılı decellularizasyon, histolojik ve DNA analizleri ile doğrulandı ve farklı oranlarda sinir kompozit hidrojelleri, jelleşme kinetiği ve kompresyon testleri ile karakterize edildi. Sinir kompozit hidrojellerdeki hASC'lerin canlılığı, bu hidrojelin bir 3D hücre kültürü platformu olarak kullanılabileceğini kanıtlamak için araştırıldı.

Protokol

Domuz dokuları ticari olarak elde edildi, bu nedenle hayvan etik komitesi tarafından onay gerekmedi.

1. Domuz omuriliklerinin hücreden arındırılması (Tahmini süre: 5 gün)

NOT:25,26 değişiklikleriyle önceden oluşturulmuş protokolleri kullanarak hücre gidermeyi gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm çözeltiler, bir şişe üstü filtre (0.2 μm gözenek boyutu) kullanılarak otoklavlanmış şişelere steril olarak filtrelenmelidir. 37 °C'de yapılacak işlemler bir inkübatör veya 37 °C'ye ayarlanmış temiz bir fırın içinde yapılabilir.

  1. Hücre giderme solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: Tüm çözeltiler 1 L için hesaplanmıştır. Kullanıcıların deneysel ihtiyaçlarına göre gerekli nihai hacmi ayarlamaları gerekebilir.
    1. % 0.025 tripsin / EDTA yapmak için 500 mL %0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
    2. % 3 Triton X-100 yapmak için 300 mL %10 Triton X-100'ü 700 mL PBS ile seyreltin. 100 mM Na/50 mM fos tamponu yapmak için 0.56 g NaCl, 1.31 g NaH2PO4H2O ve 10.85 gHNa 2O4P·7H2O'yu 1 L deiyonize suda karıştırın.
    3. 1 M sükroz yapmak için 32.4 g sakarozu 1 L deiyonize suda karıştırın. % 4 SD çözeltisi elde etmek için 40 g sodyum deoksikolat (SD) 1 L deiyonize su içinde karıştırın. 6.7 mL %15 perasetik asidi 993.3 mL %4 etanol ile seyreltin.
  2. Domuz omuriliğinin hazırlanması
    NOT: Omurilikler herhangi bir çözelti olmadan donmuş olarak sevk edildi ve kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu.
    1. Hücreden arındırmadan önce omuriliği buzdolabında 4 °C'de 18-24 saat çözdürün. Dura mater'i dikkatlice çıkarmak için steril makas kullanın.
    2. Omuriliği küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 cm uzunluğunda). Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe veya en fazla üç parçayı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Omuriliğin hücreden çıkarılması
    NOT: Her adımdan sonra, hücre giderme çözeltileri atılmak üzere büyük bir behere manuel olarak dökülür. Küçük otoklavlanabilir paslanmaz çelik süzgeç, her adım için gereken dokuları kaybetmeden hücre giderme solüsyonlarının atılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe omurilik 83 rpm'de ajite edildi.
    1. Omuriliği deiyonize su ile 4 ° C ve 60 rpm'de 18-24 saat durulayın.
    2. Omuriliği %0.025 tripsin/EDTA ile 37 °C ve 40 rpm'de 1 saat durulayın. Ardından, omuriliği PBS ile 15 dakika, 2 kez durulayın.
    3. Omuriliği 2 saat% 3 Triton X-100 ile durulayın. Omuriliği 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 2x durulayın.
    4. Omuriliği 1 saat boyunca 1 M sükroz ile durulayın. Daha sonra omuriliği 1 saat deiyonize su ile durulayın.
    5. Omuriliği 2 saat boyunca% 4 SD ile durulayın. Daha sonra omuriliği 100 mM Na/50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 2x durulayın.
    6. Omuriliği 4 saat boyunca% 4 etanol içinde% 0.1 perasetik asit ile durulayın. Ardından, omuriliği 1 saat boyunca PBS ile durulayın.
    7. Omuriliği deiyonize su ile 1 saat, 2 kez durulayın. Ardından, omuriliği 1 saat boyunca PBS ile durulayın.
    8. Omuriliği 0.01 mbar ve -56 °C'de 3 gün boyunca liyofilize edin ve kullanana kadar kuru olarak saklayın.

2. Domuz siyatik sinirinin hücreden arındırılması (Tahmini süre: 5 gün)

NOT: Önceden oluşturulmuş bir protokol27 kullanarak hücre hücreden arındırma işlemini gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm çözeltiler, bir şişe üstü filtre (0.2 μm gözenek boyutu) kullanılarak otoklavlanmış şişelere steril olarak filtrelenmelidir. 37 °C'de yapılacak işlemler bir inkübatör veya 37 °C'ye ayarlanmış temiz bir fırın içinde yapılabilir.

  1. Hücre giderme solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: Tüm çözeltiler 1 L için hesaplanmıştır. Kullanıcıların deneysel ihtiyaçlarına göre gerekli nihai hacmi ayarlamaları gerekebilir.
    1. 1.86 g NaCl, 0.262 g d NaH2PO4H2O ve 2.17 gHNa 2O4P 7H2O 1 L deiyonize su içinde karıştırarak 50 mM Na / 10 mM fos tamponu hazırlayın.
    2. 38.4 g SB-10'u 1 L 50 mM Na/10 mM fos tamponunda karıştırarak 125 mM sülfobetain-10 (SB-10) çözeltisi hazırlayın.
    3. 1 L 50 mM Na/10 mM fos tamponunda 30 g SD ve 0.24 g SB-16'yı karıştırarak% 3 SD / 0.6 mM sülfobetain-16 (SB-16) çözeltisi hazırlayın.
  2. Domuz siyatik sinirinin hazırlanması
    NOT: Siyatik sinirler PBS ile donmuş olarak sevk edildi ve kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu.
    1. Siyatik siniri, hücreden arındırmadan 18-24 saat önce buzdolabında 4 °C'de çözdürün.
    2. Siyatik siniri küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 cm uzunluğunda). Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe veya en fazla üç parçayı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Siyatik sinirin hücrelerden arındırılması
    NOT: Her adımdan sonra, hücre giderme solüsyonları atılmak üzere büyük bir behere manuel olarak dökülür ve her adım için gereken dokuları kaybetmeden hücre giderme solüsyonlarının atılmasına yardımcı olmak için küçük bir otoklavlanabilir paslanmaz çelik süzgeç kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe siyatik sinir 15 rpm'de ajite edildi.
    1. Siyatik siniri 7 saat boyunca deiyonize su ile durulayın. Daha sonra siyatik siniri 125 mM sülfobetain-10 (SB-10) ile 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda 18 saat durulayın.
    2. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika durulayın. Daha sonra siyatik siniri 2 saat boyunca 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda% 3 SD / 0.6 mM sülfobetain-16 (SB-16) ile durulayın.
    3. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 50 mM Na/10 mM fos tamponunda 125 mM SB-10 ile 7 saat durulayın.
    4. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika durulayın. Daha sonra siyatik siniri 1.5 saat boyunca 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda% 3 SD / 0.6 mM SB-16 ile durulayın.
    5. Siyatik siniri 50 mM Na / 10 mM fos tamponu ile 15 dakika, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 75 U / mL deoksiribonükleaz (DNaz) ile 3 saat çalkalama olmadan durulayın.
    6. Siyatik siniri 50 mM Na / 10 mM fos tamponu ile 1 saat, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 0.2 U/mL Kondroitinaz ABC ile 37 ° C'de çalkalamadan 16 saat boyunca durulayın.
    7. Siyatik siniri PBS ile 3 saat, 3 kez durulayın. Siyatik siniri 0.01 mbar ve -56 °C'de 3 gün boyunca liyofilize edin ve kullanana kadar kuru tutun.

3. Decellularized dokuların sindirimi ve kompozit hidrojellerin üretimi (Tahmini süre: 4 gün)

  1. Hücrelerden arındırılmış dokuları makas veya homojenizatör kullanarak toz haline getirin veya öğütün. Dokuları doğramak veya öğütmek için aletleri 121 °C'de 45 dakika boyunca bir otoklav kullanarak sterilize edin. Etilen oksit yöntemi de uygulanabilir.
  2. Dokuları, 15 mg / mL konsantrasyonda 1 mg / mL pepsin içeren 0.01 N hidroklorik asit (HCl) çözeltisinde ayrı ayrı sindirin. Decellularized omurilik ve siyatik sinirin tahmini ağırlıkları parça başına sırasıyla 50-100 mg ve 100-150 mg'dır.
  3. Manyetik çubuğu yerleştirin ve prejel çözeltileri oluşturmak için en az 500 gün boyunca 4 rpm ve 4 °C'de karıştırın.
  4. Siyatik sinir ve omurilik prejelini aşağıdaki hacimsel oranlarda karıştırın: 2: 1, 1: 1 ve 1: 2. 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve HCl kullanarak pH 7.4'ü ayarlayın ve M199 ortamı ve 1x PBS kullanarak istenen konsantrasyona seyreltin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bir seferde 1 μL NaOH ekleyin. M199 ortamı, pH 7.4 olduğunda açık pembeye döndüğü için bir pH indikatörü olarak kullanılabilir, ancak pH seviyesini doğrulamak için pH şeritleri kullanılmalıdır.

4. Hücresellikten çıkarmanın doğrulanması

  1. Hematoksilen ve Eozin boyaması (H&E; Tahmini süre: 8 gün)
    NOT: Her durulama adımından sonra, çözeltiler atılmak üzere manuel olarak büyük bir behere dökülür.
    1. Taze ve hücresizleştirilmiş omurilik ve siyatik siniri% 3.7 formaldehit içinde 4 ° C'de 18 saat sabitleyin. Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    2. Formaldehiti çıkarın ve dokuları 1 gün boyunca% 10 sükroz içine yerleştirin. % 10 sükrozu çıkarın ve dokuları 6 gün boyunca% 30 sükroz içine yerleştirin.
    3. Uygun boyutta bir kriyokalıbı optimum kesme sıcaklığı (OCT) ile yarıya kadar doldurun. Hücreden arındırılmış dokuları yerleştirin, üzerlerini OCT ile örtün ve 1 gün boyunca OCT'yi emmelerine izin verin.
    4. 1 gün sonra dokuları gece boyunca -80 °C'de dondurun. Bir kriyostat kullanarak dokuları 10 μm kalınlığında kriyoseksiyon yapın.
    5. 1x PBS ile 5 dakika, 2x durulayın. Ardından musluk suyu ile 5 dakika durulayın.
    6. 1 dakika hematoksilen çözeltisi ile boyayın. Musluk suyu ile 1 dakika, 3 kez durulayın.
    7. 1 dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin. %95 etanol ile 1 dakika, 2x ve %100 etanol ile 1 dakika, 3 kez durulayın.
    8. Ksilen ile 1 dakika, 2 dakika ve ardından 1 dakika durulayın. Slaytları 5 dakika kurumaya bırakın.
    9. Slaytların üzerine 3-4 damla dibutilftalat polistiren ksilen (DPX) montaj solüsyonu damlatmak için pamuklu çubuk kullanın. Lamelleri DPX kaplı slaytların üzerine yerleştirin. Slaytları gece boyunca kurumaya bırakın.
  2. DNA analizi (Tahmini süre: 1 saat)
    1. Decellularized ve liyofilize dokuları tartın. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak DNA'yı izole edin ve miktarını belirleyin.

5. Kompozit hidrojellerin karakterizasyonu

  1. Jelleşme bulanıklık testi (Tahmini süre: 1 saat)
    1. Buz üzerindeki 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 μL prejel çözeltisi yerleştirin. Bir plaka okuyucu kullanarak 45 dakika boyunca her 2 dakikada bir 405 nm'de absorbansı okuyun.
    2. Aşağıdaki denklemi kullanarak normalleştirilmiş absorbansı hesaplayın:
      (Absorbans - AbsorbansBaşlangıcı) / (AbsorbansMaksimum - AbsorbansBaşlangıcı)
    3. Eğrinin eğimini ve sırasıyla %50 ve %95 jelleşme, t1/2 ve t95 elde etme süresini hesaplayın.
  2. Sıkıştırma testi (Tahmini süre: hidrojel başına 1 dakika)
    1. 8 mm çapında ve 2 mm yüksekliğinde 12 mg / mL konsantrasyonda kompozit hidrojeller üretin.
    2. Numuneleri, paslanmaz çelik paralel plakalar arasında 250 N'luk bir yük ile numune yüksekliğinin/dk'nın %10'u kadar bir gerinim hızında sıkıştırmak için bir reometre kullanın. Reometre okumaları sağlayan yazılım, kuvveti uygulayarak ve hidrojeller kırılana kadar gerinim ölçerek bir gerilim-gerinim eğrisi sağlayacaktır.
    3. Gerilim-gerinim eğrilerinin doğrusal bölgesinin eğiminden Young modülünü hesaplayın.

6. Sinir kompozit hidrojellerde insan ASC'lerinin üç boyutlu kültürü

  1. Üç boyutlu (3D) platformun hazırlanması (Tahmini süre: 3 saat)
    1. 200 μm derinliğinde ve 4 mm çapında dairesel desenler oluşturmak için SU-8 fotorezist ile silikon gofret aşındırın.
    2. Polidimetilsiloksan (PDMS) bazını ve kürleme maddesini 10:1 oranında karıştırın. Karışımı silikon gofret üzerine dökün ve PDMS tabanı ile kürleme maddesinin karıştırılmasından kaynaklanan tüm kabarcıkları çıkarmak için 20 dakika bekletin.
    3. Fırına koyun ve 70 °C'de 2 saat kürleyin. Kürlenmiş PDMS tabakasını kalıptan çıkarın ve PDMS mikro kuyuları yapmak için 8 mm çapında bir biyopsi zımbası kullanarak delin.
    4. Mikro kuyuları 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve PDMS mikro kuyularını sterilize etmek için kuyu plakasını bir hava-plazma temizleyicisine koyun.
    5. PDMS mikro kuyularını sırasıyla 10 dakika ve 20 dakika boyunca %1 polietilenimin (PEI) ve %0.1 glutaraldehit (GA) ile işlevselleştirin. Mikro kuyuları 2 kez damıtılmış suyla yıkayın.
  2. hASC'lerin hazırlanması (Tahmini süre: 7 gün)
    1. Birleşene kadar hASC'lerin büyüme ortamında (fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (Pen-strep) ile desteklenmiş hASC'lerin bazal ortamı) 2-5 geçiş için kültür geçiş hücreleri. Bir hematitometre veya hücre sayacı kullanarak hücre sayısını geçin ve hesaplayın.
  3. ASC yüklü sinir kompozit hidrojeller (Tahmini süre: 2 saat)
    1. Siyatik sinir ve omurilik prejelini 2:1, 1:1, 1:2 hacimsel oranda karıştırın ve herhangi bir siyatik sinir prejeli karıştırmadan sadece omurilik hidrojeli hazırlayın.
    2. M199 ortamı ekleyin ve 1 N, NaOH ve HCl kullanarak pH 7.4'ü ayarlayın. hASC'leri prejelde 1 x 106 hücre / mL yoğunlukta büyüme ortamı ile yeniden askıya alın.
      NOT: M199 ve hücre süspansiyonu miktarı, pregelin% 10'u olmalıdır.
    3. Prejeli 1x PBS kullanarak 12 mg / mL'ye seyreltin. Prejeli mikro kuyucuklara yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. hASC'lerin büyüme ortamlarında ASC yüklü hidrojellerin kültürü.
  4. Hücre canlılık testi (Tahmini süre: günde 4 saat)
    1. Üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan reaktifleri kullanarak canlılık testi çözümleri hazırlayın.
    2. 1., 4., 7. ve 14. günlerde ortamı aspire edin. Kuyucuklara reaktif ekleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
    3. Bir plaka okuyucu kullanarak 560/590 nm uyarma/emisyonda floresan okuyun. Aşağıdaki denklemi kullanarak yüzde farkını hesaplayın:
      [(floresannumunesi- floresanboş) / floresanboş] x 100

Sonuçlar

Deselüler dokular, daha önce belirlenmiş protokoller kullanılarak hafif değişikliklerlehazırlandı 26,27. Decellularizasyon, liyofilizasyon ve sindirimden sonra, SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 oranlarında sinir kompozit hidrojeller ve sadece omurilik hidrojelleri üretildi (Şekil 1). Nükleer bileşenlerin çıkarılması H&E boyama ile doğrulandı (Şekil 2A). Decellul...

Tartışmalar

SKY patofizyolojisinin karmaşık ve çok yönlü olduğuna inanılmaktadır. Hücre nakli, ilaç dağıtımı ve biyomateryaller gibi tek tedavilerin her biri SKY hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, SCI'nin karmaşık doğası bireysel etkinliklerini sınırlayabilir 28,29,30,31. Bu nedenle, etkili kombinatoryal terapötikler geliştirme çabalar?...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, PhRMA Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından YS'ye verilen P20GM139768 ve R15NS121884 numaralı ödülle desteklenmiştir. Arkansas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Kartik Balachandran ve Dr. Raj Rao'ya ekipmanlarını kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca, Arkansas Üniversitesi Biyoloji ve Ziraat Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Jin-Woo Kim ve Bay Patrick Kuczwara'ya reometre konusunda eğitim verdikleri için teşekkür etmek istiyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner saltSigma-AldrichD4266Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonateSigma-AldrichH6883Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagentFisher ScientificDAL1100Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Used during sciatic nerve decellularization
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrateVWRBDH9296Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting mediumSigma-Aldrich6522Used during H&E staining
EosinSigma-AldrichHT110216Used during H&E staining
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Used during PDMS surface functionalization
hASC growth mediaLonzaPT-4505Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
HematoxylinVWR26041-06Used during H&E staining
human adipose-derived stem cellLonzaPT-5006
Hydrochloric acid (HCl)Sigma-Aldrich320331Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 mediaSigma-AldrichM0650Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compoundTissue-Tek4583
PepsinSigma-AldrichP7000Used to digest decellularized tissues
Peracetic acidLab AlleyPAA1001Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerveTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cordTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA systemPromegaE2670Used to analyze DNA contents
RheometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)VWRBDH9286Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateVWRBDH9298Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)Sigma-Aldrich415443Used to adjust pregels solutions
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Used to coat silicon wafer
SucroseSigma-AldrichS8501Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW1317318Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100Sigma-AldrichX100Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300062Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Used during sciatic nerve decellularization
XyleneVWRMK866816Used during H&E staining

Referanslar

  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, 120596 (2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117 (2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692 (2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18 (2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110 (2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101 (2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269 (2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762 (2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kombinatoryal Terap tiklerOmurilik YaralanmasK k H cre VerilmesiTravmatik SCIH cre D Matrisler3D HidrojellerDesel ler OmuriliklerSiyatik SinirlerDoku M hendisli iMezenkimal K k H crelerN ro rejeneratif Stratejiler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır