Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.
Çok türlü biyofilm, rizosfer toprağı da dahil olmak üzere doğada doğal olarak oluşan ve baskın bir bakteri yaşam tarzıdır, ancak mevcut anlayışı sınırlıdır. Burada, sinerjik çok türlü biyofilm topluluklarını hızlı bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. İlk adım, diferansiyel santrifüjleme yöntemini kullanarak hücreleri rizosfer toprağından çıkarmaktır. Daha sonra, bu toprak hücreleri, pelikül biyofilmi oluşturmak için kültür ortamına aşılanır. 36 saatlik inkübasyondan sonra, biyofilmin bakteri bileşimi ve altındaki çözelti, 16S rRNA gen amplikon dizileme yöntemi kullanılarak belirlenir. Bu arada, pelikül biyofilminden yüksek verimli bakteri izolasyonu, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, çok türlü biyofilm topluluklarının oluşturulmasında daha fazla kullanım için 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerinde (pelikül biyofilm örnekleri) en yüksek bolluğa sahip ilk 5 bakteri taksonu seçilir. 5 bakteri taksonunun tüm kombinasyonları, kristal viyole boyama testi ile en güçlü biyofilm oluşturma yeteneği için seçilen ve qPCR ile ölçülen 24 oyuklu bir plaka kullanılarak hızlı bir şekilde oluşturuldu. Son olarak, en sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm toplulukları yukarıdaki yöntemlerle elde edildi. Bu metodoloji, rizosfer çok tür biyofilmi hakkında araştırma yapmak ve bu türler arasındaki etkileşimleri yöneten ilkeleri incelemek için temsili toplulukları belirlemek için bilgilendirici rehberlik sağlar.
Biyofilmler, yüzeylere yapıştırılmış veya arayüzlerle bağlantılı karmaşık mikrobiyal toplulukları temsil eder. Doğal yaşam alanları, klinik ortamlar ve endüstriyel bağlamlar gibi çeşitli ortamlarda karşılaşılan bakterilerin çoğunun biyofilm toplulukları içinde devam ettiği geniş bir kabul görmektedir1. Toprakta, kök yüzeyini ve bitişik 2 mm kalınlığındaki bölgeyi kapsayan rizosfer, yüksek besin mevcudiyeti ile ekolojik bir niş oluşturur. Spesifik bakteriler, mikrobiyal çoğalmayı teşvik ederek ve rizosferdebiyofilm topluluklarının oluşumunu teşvik ederek bu nişten yararlanmak için stratejiler geliştirmiştir 2.
Bu protokol genellikle çeşitli bitkilerden elde edilen rizosfer toprak mikrobiyotasına uygulanabilir. Burada örnek olarak salatalık kullanılmıştır. Çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Bakteri izolasyonu
Söz konusu prosedürü takiben, salatalık rizosfer toprak mikrobiyotasından biyofilm oluşturma kapasitesinde önemli gradyanlar gözlenir (Şekil 1). Biyofilm amplikon dizilimi, peliküldeki türü doğruladı (Şekil 2). Sıralama verilerinin ısı haritalamasına dayanarak, peliküldeki bolluğu kalan çözeltidekinden daha büyük olan ilk beş bakteri türü seçildi (Şekil 3). Burada, tipik bir sentetik topluluk grubu örn.......
Protokolü takiben, farklı bitkilerden elde edilen rizosfer toprağındaki mikrobiyotaya dayalı olarak bir dizi sağlam sentetik çok türlü biyofilm topluluğu oluşturulur. Kantitatif PCR teknikleri kullanılarak, her topluluğun bileşimi net bir şekilde deşifre edilir. Biyofilmin biyokütlesi, potansiyel metabolik etkileşimlerinin gücünü gösterir, ancak işbirliğinin arkasındaki çeşitli özellikler ve mekanizmalar burada ortaya çıkarılamamıştır19. Doğal mikrobiyal topluluk.......
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (42307173 ve 42107328) ve Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFD1500202 ve 2022YFF1001800) tarafından mali olarak desteklenmiştir. P.W, Z.X çalışmayı tasarladı. P.W, B.X, Z.C, J.X ve N.Z verileri analiz etti ve rakamları oluşturdu. P.W el yazmasının ilk taslağını yazdı. Z.X., R.Z. ve Q.S. el yazmasını gözden geçirdiler.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 % Na4P2O7 solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 20041418 | Used to dilute the soil suspension. |
100 μm Nylon Cell Filter | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | F613463-0001 | Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm. |
2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | L03336903 | Used to sterilize the seeds. |
24-well Plate | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation. |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Bioolook Scientific Research Special | 2360010 | Used to prepare MSgg media. |
50 mL Centrifuge Tube | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Properly-sized centrifuge tubes for our protocol. |
75% C2H5OH solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 801769680 | Used to sterilize the seeds. |
Acinetobacter baumannii XL-1 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
Bacteria DNA Kit | Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. | D3350020000K04U021 | Used to extract bacterial DNA. |
Black Soil I | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Jilin Province. |
Black Soil II | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Heilongjiang Province. |
Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
CaCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10035048 | Used to prepare MSgg media. |
Centrifuge | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | G508009-0001 | High-speed centrifuge. |
ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co.,Ltd. | Q311-02 | Used for DNA amplification in qPCR. |
Clean Bench | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Used for aseptic operation. |
Constant Temperature Incubator | ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd | GNP-9080BS-![]() | Used for microbial cultivation. |
Cristal Violet Dye | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | A600331 | Used for pellicle biofilm staining and quantifivation. |
Cucumber Seed | Nanjing Agricultural University | N/A | "Jinchun I" cucumber seed. |
Culturome v 1.0 | The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification |
FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011918 | Used to prepare MSgg media. |
Fridge | Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. | BCD-556WKPM(Q) | Used for strain preservation. |
Glutamate | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010618 | Used to prepare MSgg media. |
Hydroponic Planting Basket | Yulv Furniture Store | 6526262626 | Used for cucumber hydroponics. |
KH2PO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10017618 | Used to prepare MSgg media. |
MgCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 7791186 | Used to prepare MSgg media. |
MnCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10400101 | Used to prepare MSgg media. |
Msgg Medium | Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. | BES20791KB | Pellicle biofilm culture medium. |
Na2HPO4·7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | Used to prepare TSB media. |
NaCI | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | Used to prepare TSB media. |
NaH2PO4·H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | Used to prepare TSB media. |
PBS-S Buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | E607008-0001 | Basic buffer for living tissues. |
Phenylalanine | RYON | RT3486L005 | Used to prepare MSgg media. |
Pipette | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | BS-1000-T | Used for strain inoculation. |
PMD19T Plasmid | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. | D102A | Used to generate qPCR standard curves. |
Pot | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | YHHWS2401 | Used for cucumber soil culture. |
Primer for qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
Real-Time PCR Instrument | Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. | 4484073 | Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm. |
Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Used to design primers of qPCR |
Shaker | Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd | ZQTY-50S | Used for solution mixing and microbial cultivation. |
Silwet L-77 | Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | Used to prepare TSB media. |
Soy peptone | Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | Used to prepare TSB media. |
Spectrophotometer | Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. | 76713100010 | Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation. |
Sterile Water | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | SW150302 | Used to wash the pellicle biofilm. |
Sterilized Nitrile Gloves | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | 223016852LLZA | Used for basic experimental operations. |
Template DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
Thiamine | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Used to prepare TSB media. |
Tryptophan | Bioolook Scientific Research Special | 2190020 | Used to prepare MSgg media. |
TSB Medium | Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. | 024048 | Broad-spectrum bacterial medium. |
TSB-Msgg Meidium | Nanjing Agricultural University | N/A | Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability. |
ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd | C0310520123 | Used to prepare MSgg media. |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.