Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.

Özet

Çok türlü biyofilm, rizosfer toprağı da dahil olmak üzere doğada doğal olarak oluşan ve baskın bir bakteri yaşam tarzıdır, ancak mevcut anlayışı sınırlıdır. Burada, sinerjik çok türlü biyofilm topluluklarını hızlı bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. İlk adım, diferansiyel santrifüjleme yöntemini kullanarak hücreleri rizosfer toprağından çıkarmaktır. Daha sonra, bu toprak hücreleri, pelikül biyofilmi oluşturmak için kültür ortamına aşılanır. 36 saatlik inkübasyondan sonra, biyofilmin bakteri bileşimi ve altındaki çözelti, 16S rRNA gen amplikon dizileme yöntemi kullanılarak belirlenir. Bu arada, pelikül biyofilminden yüksek verimli bakteri izolasyonu, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, çok türlü biyofilm topluluklarının oluşturulmasında daha fazla kullanım için 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerinde (pelikül biyofilm örnekleri) en yüksek bolluğa sahip ilk 5 bakteri taksonu seçilir. 5 bakteri taksonunun tüm kombinasyonları, kristal viyole boyama testi ile en güçlü biyofilm oluşturma yeteneği için seçilen ve qPCR ile ölçülen 24 oyuklu bir plaka kullanılarak hızlı bir şekilde oluşturuldu. Son olarak, en sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm toplulukları yukarıdaki yöntemlerle elde edildi. Bu metodoloji, rizosfer çok tür biyofilmi hakkında araştırma yapmak ve bu türler arasındaki etkileşimleri yöneten ilkeleri incelemek için temsili toplulukları belirlemek için bilgilendirici rehberlik sağlar.

Giriş

Biyofilmler, yüzeylere yapıştırılmış veya arayüzlerle bağlantılı karmaşık mikrobiyal toplulukları temsil eder. Doğal yaşam alanları, klinik ortamlar ve endüstriyel bağlamlar gibi çeşitli ortamlarda karşılaşılan bakterilerin çoğunun biyofilm toplulukları içinde devam ettiği geniş bir kabul görmektedir1. Toprakta, kök yüzeyini ve bitişik 2 mm kalınlığındaki bölgeyi kapsayan rizosfer, yüksek besin mevcudiyeti ile ekolojik bir niş oluşturur. Spesifik bakteriler, mikrobiyal çoğalmayı teşvik ederek ve rizosferdebiyofilm topluluklarının oluşumunu teşvik ederek bu nişten yararlanmak için stratejiler geliştirmiştir 2.

Protokol

Bu protokol genellikle çeşitli bitkilerden elde edilen rizosfer toprak mikrobiyotasına uygulanabilir. Burada örnek olarak salatalık kullanılmıştır. Çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bakteri izolasyonu

  1. Rizosfer toprak izolasyonu
    1. Salatalık kültürü
      1. Salatalık tohumlarını% 75 etanol ve% 2 sodyum hipoklorit (NaClO) çözeltisi ile dezenfekte edin, ardından steril sudadurulayın 11.
      2. Tohumları steril koşullar altında çimlendirin ve iki yapraklı aşama12'ye ulaşanları seç....

Temsili Sonuçlar

Söz konusu prosedürü takiben, salatalık rizosfer toprak mikrobiyotasından biyofilm oluşturma kapasitesinde önemli gradyanlar gözlenir (Şekil 1). Biyofilm amplikon dizilimi, peliküldeki türü doğruladı (Şekil 2). Sıralama verilerinin ısı haritalamasına dayanarak, peliküldeki bolluğu kalan çözeltidekinden daha büyük olan ilk beş bakteri türü seçildi (Şekil 3). Burada, tipik bir sentetik topluluk grubu örn.......

Tartışmalar

Protokolü takiben, farklı bitkilerden elde edilen rizosfer toprağındaki mikrobiyotaya dayalı olarak bir dizi sağlam sentetik çok türlü biyofilm topluluğu oluşturulur. Kantitatif PCR teknikleri kullanılarak, her topluluğun bileşimi net bir şekilde deşifre edilir. Biyofilmin biyokütlesi, potansiyel metabolik etkileşimlerinin gücünü gösterir, ancak işbirliğinin arkasındaki çeşitli özellikler ve mekanizmalar burada ortaya çıkarılamamıştır19. Doğal mikrobiyal topluluk.......

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (42307173 ve 42107328) ve Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFD1500202 ve 2022YFF1001800) tarafından mali olarak desteklenmiştir. P.W, Z.X çalışmayı tasarladı. P.W, B.X, Z.C, J.X ve N.Z verileri analiz etti ve rakamları oluşturdu. P.W el yazmasının ilk taslağını yazdı. Z.X., R.Z. ve Q.S. el yazmasını gözden geçirdiler.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 % Na4P2O7 solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.20041418Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell FilterSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.F613463-0001Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.L03336903Used to sterilize the seeds.
24-well PlateMerck & Co., Inc.PSRP010Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)Bioolook Scientific Research Special2360010Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge TubeBeijing Su-bio Biotech Co., Ltd.62.547.254Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.801769680Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA KitNanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.D3350020000K04U021Used to extract bacterial DNA.
Black Soil INanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Jilin Province.
Black Soil IINanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10035048Used to prepare MSgg media.
CentrifugeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.G508009-0001High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co.,Ltd.Q311-02Used for DNA amplification in qPCR.
Clean BenchSuzhou Antai Airtech Co., Ltd.NB026143Used for aseptic operation.
Constant Temperature IncubatorShangHai CIMO Medical Instrument Co.,LtdGNP-9080BS-figure-materials-3074Used for microbial cultivation.
Cristal Violet DyeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.A600331Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber SeedNanjing Agricultural UniversityN/A"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of SciencesN/AUsed for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011918Used to prepare MSgg media.
FridgeHefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.BCD-556WKPM(Q)Used for strain preservation.
GlutamateBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010618Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting BasketYulv Furniture Store6526262626Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4Xilong Scientific Co.,Ltd.10017618Used to prepare MSgg media.
MgCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.7791186Used to prepare MSgg media.
MnCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10400101Used to prepare MSgg media.
Msgg MediumShanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.BES20791KBPellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2OMerck & Co., Inc.S9390-100GUsed to prepare TSB media.
NaCIChinasun Specialty Products co., Ltd.HS0416Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2OMerck & Co., Inc.S9638-25GUsed to prepare TSB media.
PBS-S BufferSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.E607008-0001Basic buffer for living tissues.
PhenylalanineRYONRT3486L005Used to prepare MSgg media.
PipetteBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.BS-1000-TUsed for strain inoculation.
PMD19T PlasmidTakara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.D102AUsed to generate qPCR standard curves.
PotSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.YHHWS2401Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCRSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR InstrumentThermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.4484073Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
RoaryThe Wellcome Trust SangerInstituteN/AUsed to design primers of qPCR
ShakerShanghai Zhichu Instrument Co.,LtdZQTY-50SUsed for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.SL77080596Used to prepare TSB media.
Soy peptoneQingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., LtdHB8275Used to prepare TSB media.
SpectrophotometerShanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.76713100010Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile WaterSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.SW150302Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile GlovesBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.223016852LLZAUsed for basic experimental operations.
Template DNASangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
ThiamineBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
TryptoneThermo Fisher ScientificLP0042BUsed to prepare TSB media.
TryptophanBioolook Scientific Research Special2190020Used to prepare MSgg media.
TSB MediumGuangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.024048Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg MeidiumNanjing Agricultural UniversityN/AMixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2Nanjing Chemical Reagent Co.,LtdC0310520123Used to prepare MSgg media.

Referanslar

  1. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.