Rizosfer Toprağından Çok Türlü Biyofilm Toplulukları Oluşturmaya Yönelik Bir Yaklaşım

Özet

Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.

Özet

Çok türlü biyofilm, rizosfer toprağı da dahil olmak üzere doğada doğal olarak oluşan ve baskın bir bakteri yaşam tarzıdır, ancak mevcut anlayışı sınırlıdır. Burada, sinerjik çok türlü biyofilm topluluklarını hızlı bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. İlk adım, diferansiyel santrifüjleme yöntemini kullanarak hücreleri rizosfer toprağından çıkarmaktır. Daha sonra, bu toprak hücreleri, pelikül biyofilmi oluşturmak için kültür ortamına aşılanır. 36 saatlik inkübasyondan sonra, biyofilmin bakteri bileşimi ve altındaki çözelti, 16S rRNA gen amplikon dizileme yöntemi kullanılarak belirlenir. Bu arada, pelikül biyofilminden yüksek verimli bakteri izolasyonu, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, çok türlü biyofilm topluluklarının oluşturulmasında daha fazla kullanım için 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerinde (pelikül biyofilm örnekleri) en yüksek bolluğa sahip ilk 5 bakteri taksonu seçilir. 5 bakteri taksonunun tüm kombinasyonları, kristal viyole boyama testi ile en güçlü biyofilm oluşturma yeteneği için seçilen ve qPCR ile ölçülen 24 oyuklu bir plaka kullanılarak hızlı bir şekilde oluşturuldu. Son olarak, en sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm toplulukları yukarıdaki yöntemlerle elde edildi. Bu metodoloji, rizosfer çok tür biyofilmi hakkında araştırma yapmak ve bu türler arasındaki etkileşimleri yöneten ilkeleri incelemek için temsili toplulukları belirlemek için bilgilendirici rehberlik sağlar.

Giriş

Biyofilmler, yüzeylere yapıştırılmış veya arayüzlerle bağlantılı karmaşık mikrobiyal toplulukları temsil eder. Doğal yaşam alanları, klinik ortamlar ve endüstriyel bağlamlar gibi çeşitli ortamlarda karşılaşılan bakterilerin çoğunun biyofilm toplulukları içinde devam ettiği geniş bir kabul görmektedir¹. Toprakta, kök yüzeyini ve bitişik 2 mm kalınlığındaki bölgeyi kapsayan rizosfer, yüksek besin mevcudiyeti ile ekolojik bir niş oluşturur. Spesifik bakteriler, mikrobiyal çoğalmayı teşvik ederek ve rizosferde^biyofilm topluluklarının oluşumunu teşvik ederek bu nişten yararlanmak için stratejiler geliştirmiştir 2.

Rizosfer mikropları, bitkilerin 'ikinci genomu' olarak kabul edilir³. Bitki büyümesini teşvik eden mikroorganizmalar (PGPM), bitkilerle karşılıklı simbiyoz yaparak önemli büyüme teşviki ve biyokontrol işlevleri sağlar⁴. Bir yandan, PGPM bitki köklerine besin sağlayabilir, besin alımını artırabilir, patojenlere karşı savunma yapabilir ve rizosfer toprağındaki kirleticileri bozabilir⁵. Öte yandan, PGPM, bitki kökü eksüdalarını büyüme ve evrim için bir besin kaynağı olarak kullanır ve böylece rizosfer toprağını ve kök sistemini kendi metabolizmaları yoluyla etkiler. Tüm bu işlevler için ön koşulun, PGPM'nin bitki rizosferinde etkili bir şekilde kolonizasyonu ve kararlı biyofilmler^{oluşturması} olduğunu belirtmek gerekir 6.

Rizosfer biyofilmi, rizosfer mikroplarının montaj sürecini etkiler ve rizosfer mikrop montajının zamansal ve mekansal özellikleri, çok türlü biyofilm^7'nin etkileşimi ile yakından ilişkilidir. Bitki-mikrobiyom etkileşimlerinin merkezi olarak hizmet eder ve etkili bir şekilde etkileşime girmeleri için istikrarlı ve kontrol edilebilir bir niş sağlar. Bu nedenle, rizosfer biyofilmini incelemek, bitkiler ve mikroplar arasındaki etkileşim hakkında fikir edinmek için de önemli bir yöndür.

Bununla birlikte, şu anda rizosfer çok türlü biyofilmler hakkında çok az araştırma bulunmaktadır. Mikrobiyom bileşiminin yüksek karmaşıklığı, doğal mikrobiyal toplulukları çevreleyen temel ekolojik soruları yanıtlamayı zorlaştırmaktadır⁸. Deney sürecinde, toprak tipi, bitki türü ve çok sayıda mikrobiyal topluluk gibi birçok koşulun dikkate alınması gerekir. Rizosfer çok türlü biyofilmlerin araştırılmasını çeşitli faktörler sınırlamaktadır.

Türler arası sinerjik etkileşimler veya metabolit çapraz beslemesi⁸ gibi rizosfer toprağından çok türlü biyofilm topluluklarını daha fazla araştırmak için, laboratuvar koşulları altında basitleştirilmiş, temsili, kararlı ve izlenebilir bir sentetik mikrobiyal topluluğun yapay olarak oluşturulması arzu edilir ^9,10. Burada, standartlaştırılmış bir protokol, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik tekniklerin birkaçını birleştirir.

Protokol

Bu protokol genellikle çeşitli bitkilerden elde edilen rizosfer toprak mikrobiyotasına uygulanabilir. Burada örnek olarak salatalık kullanılmıştır. Çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bakteri izolasyonu

1. Rizosfer toprak izolasyonu
   1. Salatalık kültürü
      1. Salatalık tohumlarını% 75 etanol ve% 2 sodyum hipoklorit (NaClO) çözeltisi ile dezenfekte edin, ardından steril suda^{durulayın 11}.
      2. Tohumları steril koşullar altında çimlendirin ve iki yapraklı aşama^12'ye ulaşanları seçin. Daha sonra, sürekli olarak filizlenen salatalık fidelerini 2 kg kara toprak içeren saksılara nakledin.
         NOT: Sistematik hataları azaltmak için Kuzeydoğu Çin'in farklı yerlerinden iki tür kara toprak kullanılmaktadır.
   2. Toprak süspansiyonu hazırlığı
      1. Aşağıdaki formülasyonu kullanarak PBS-S tamponunu hazırlayın: 6.33 g NaH₂PO_{4 ·} H₂O, 16.5 g Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL Silwet L-77 ve 1 L damıtılmış su.
      2. Fideler dört yapraklı aşama^12'ye ulaştığında, saksıyı ters çevirin ve sterilize edilmiş eldivenler kullanarak kökleri 2 mm kalınlığındaki rizosfer toprağı ile birlikte izole edin.
      3. Kökleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 30 mL PBS-S tamponuna yerleştirin. 20 dakika çalkaladıktan sonra, kökleri ve büyük tortuları çıkarmak için süspansiyonu 100 μm'lik bir naylon hücre filtreden süzün.
      4. Süzüntüyü başka bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3200 x g'da santrifüjleyin ve geçici olarak 4 °C'de saklayın.
2. Rizosfer toprak bakteri hücrelerinin ekstraksiyonu.
   NOT: Bu metodoloji, diferansiyel santrifüjleme yöntemini¹³ benimser, ancak Nycodenz yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemi¹⁴ bu adım için de geçerlidir.
   1. Toprak süspansiyonunu %0.2 Na4P2O7 çözeltisiile 500 mL'ye seyreltin ve başlangıçta organizmaları topraktan ayırmak için 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   2. Çökeltiyi yeniden homojenize edin, aynı düşük hızda 60 saniye santrifüjleyin ve işlemi üç kez tekrarlayın. Süpernatanları birleştirin, 20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
   3. Çökeltiyi, rizosfer toprak bakteri hücresi süspansiyonunu oluşturan 50 mL PBS-S tamponunda yeniden süspanse edin.

2. Rizosfer biyofilm mikrobiyotasının dizilimi ve tanımlanması

1. Medya hazırlığı
   NOT: Triptik soya suyu (TSB) ve Minimal tuzlar gliserol glutamat (MSgg) ortamları ticari olarak temin edilebilir. Aşağıdaki formülasyonlar sadece referans amaçlıdır.
   1. Aşağıdaki formülasyonu kullanarak TSB ortamını hazırlayın: 15 μg/mL tripton, 5 μg/mL soya peptonu, 5 μg/mL NaCl, pH = 7.
   2. Aşağıdaki formülasyonu kullanarak MSgg ortamını hazırlayın: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM 3- (N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM tiamin,% 0.5 gliserol,% 0.5 glutamat, 50 μg / mL triptofan, 50 μg / mL fenilalanin, pH = 7 olur.
   3. TSB-MSgg ortamını hazırlamak için, TSB ortamını MSgg ortamıyla 1:1 oranında (v/v)¹⁵ karıştırın.
2. Pelikül biyofilm kokültürü
   1. Bakterileri aktive etmek için hücre süspansiyonunu TSB ortamında gece boyunca (genellikle 12 saat) 30 ° C'de inkübe edin.
   2. 100 μm naylon hücre filtrelerini 24 oyuklu plakalara yerleştirin. Bakterileri TSB ortamında inkübe edin ve üç tekrar ayarlayın. Pelikül biyofilmini 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun.
      NOT: Son adımdaki pelikül biyofilmi iyi işlenmemişse, TSB-MSgg besiyeri, TSB besiyeri için etkili bir ikamedir.
   3. Pelikül biyofilmini içeren filtreyi çıkarın. Yeni bir 24 oyuklu hücre plakasına 2 mL PBS-S tamponu ekleyin, biyofilmi yıkamak için 24 oyuklu filtreyi içine yerleştirin ve serbest hücreleri çıkarın. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
3. Pelikül biyofilm DNA'sının ekstraksiyonu
   1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA kiti kullanarak biyofilm genomunu çıkarın.
4. Yüksek verimli sıralama
   NOT: Biyoteknoloji şirketleri, çoğu laboratuvar için sıralama deneylerinin tamamlanmasına yardımcı olabilir. Kalan çözeltide mikrobiyal bileşime ihtiyaç duyulursa, bu adımda sıralayın. Sıralama adımı, aletlere bağlı olarak değişir. Lütfen üreticinin talimatlarına uyun. Adım 2.4.1 sadece referans içindir.
   1. Tam uzunlukta 16S rRNA gen dizileri ile veri tabanına dayalı olarak 16S rRNA geninin V3-V4 bölgelerini amplifiye edin. Örnek başına minimum dizi sayısına göre tür OTU'ları oluşturun¹⁶. Tür sınıflandırma ek açıklamalarını kümeleyin ve her örnekten toplulukların kompozisyonlarını elde edin.
   2. Sıralama verilerine dayanarak, nispi bollukları açısından ilk beş suşu seçin.
5. Yüksek verimli bakteri izolasyonu ve kültürü
   NOT: Bu adım, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik metodolojiye^{göre tasarlanmıştır 17}. Seyreltme kaplı plaka yöntemi, yüksek verimli tekniklere kıyasla daha fazla zaman alıcı ve daha az hedefli olmasına rağmen, burada bakteri izolasyonu için mevcuttur.
   1. Ekili biyofilmi karıştırın. 24 oyuklu plakadaki oyukların %30'undan fazlasının bakteri üremesi göstermemesini sağlamak için sınırlayıcı seyreltme kullanın.
      NOT: En uygun seyreltmeyi belirlemek için, çok çeşitli seyreltme oranları kullanarak ön deneyler yapın. Optimal seyreltme, kuyucukların% 30'undan daha azında bakteri inkübasyonunu temsil eden mililitre başına ikiden fazla kültürlenebilir bakteri içermemelidir.
   2. Kuyucuklar ve plakalar için etiketler eklerken bakterilerin 16S rRNA genini amplifiye edin ve bunları yüksek verimli Illumina platformu¹⁷ kullanarak sıralayın.
   3. Her kültür için saflık ve tür taksonomik bilgileri elde etmek için ticari olarak mevcut yazılımları kullanarak biyoinformatik analizler yapın.
   4. Sürekli hat kültürü ile en bol miktarda bulunan beş saf bakteriyi yetiştirin ve bakterileri -80 ° C'de korumak için gliserol kullanın.

3. Sentetik mikrobiyal toplulukların inşası

1. Yeniden yapılandırılmış biyofilm kültürü
   NOT: Ayrıntılar için lütfen Ren ve ^ark.18'e bakın. 5 suş, 5 tek tür, 10 iki tür, 10 üç tür, 5 dört tür ve 1 beş tür konsorsiyum dahil olmak üzere 31 sentetik kombinasyona karşılık gelir.
   1. 5 suşu, etkinleştirmek için OD_600'leri 1'e ulaşana kadar TSB ortamında inkübe edin.
   2. TSB besiyeri ile birkaç 24 oyuklu plaka hazırlayın ve üzerlerine 100 μm naylon hücre filtreleri yerleştirin.
      NOT: Son adımdan gelen biyofilm iyi işlenmemişse, TSB-MSgg ortamı, TSB ortamı için etkili bir ikamedir.
   3. Ortamdaki sentetik toplulukların 31 kombinasyonunu inkübe edin. Bakteri aşılama sayısının her kuyucukta tutarlı olduğundan emin olun. Her kombinasyon için üç tekrar ayarlayın.
   4. Biyofilmi 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun.
2. Pelikül biyofilminin miktar tayini
   1. Adım 2.2.3'teki prosedürün aynısını izleyin.
   2. Biyofilmi 180 μL kristal viyole çözeltisi içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve 20 dakika boyunca boyayın.
   3. Lekeli numuneyi 200 μL %96 etanol içeren 24 oyuklu başka bir plakaya aktarın, 30 dakika boyunca elüte edin ve OD_590'ı ölçün.

4. Pelikül hücre sayısı ölçümü

NOT: Her bir türün oranını ve pelikül ve kalan çözeltideki hücre sayılarını belirlemek için kantitatif PCR gereklidir. Ayrıntılar için Sun ve ^ark.16'ya bakın.

1. Seçilen sentetik mikrobiyal topluluklar için suşa özgü primerler tasarlayın.
2. Genom karşılaştırmaları yapmak ve her bir izolatın suşa özgü tek kopya genlerini bulmak için Roary'yi kullanın. Primerlerin bu genleri hedeflediğinden emin olun.
3. Amplifiye edilmiş fragmanları PMD19T plazmitlerine ligazlayın. Karşılık gelen parçaları içeren plazmitleri şablon olarak kullanarak standart eğriler oluşturun.
4. Adım 2.2'de belirtilen adımların aynısını izleyin.
5. Reaksiyon bileşenlerini şu şekilde hazırlayın: 7.2 μL H₂O, 10 μL 2x qPCR Master karışımı, her bir primerden 0.4 μL 10 μM ve 2 μL şablon DNA.
6. PCR'yi aşağıdaki koşullar altında Gerçek Zamanlı PCR Cihazı ile gerçekleştirin: 10 dakika boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 45 saniye boyunca 60 °C, ardından standart bir erime eğrisi segmenti.
7. Her tedavi için altı biyolojik kopya gerçekleştirin.

Sonuçlar

Söz konusu prosedürü takiben, salatalık rizosfer toprak mikrobiyotasından biyofilm oluşturma kapasitesinde önemli gradyanlar gözlenir (Şekil 1). Biyofilm amplikon dizilimi, peliküldeki türü doğruladı (Şekil 2). Sıralama verilerinin ısı haritalamasına dayanarak, peliküldeki bolluğu kalan çözeltidekinden daha büyük olan ilk beş bakteri türü seçildi (Şekil 3). Burada, tipik bir sentetik topluluk grubu örn...

Tartışmalar

Protokolü takiben, farklı bitkilerden elde edilen rizosfer toprağındaki mikrobiyotaya dayalı olarak bir dizi sağlam sentetik çok türlü biyofilm topluluğu oluşturulur. Kantitatif PCR teknikleri kullanılarak, her topluluğun bileşimi net bir şekilde deşifre edilir. Biyofilmin biyokütlesi, potansiyel metabolik etkileşimlerinin gücünü gösterir, ancak işbirliğinin arkasındaki çeşitli özellikler ve mekanizmalar burada ortaya çıkarılamamıştır¹⁹. Doğal mikrobiyal topluluk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.