Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Özet

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Sağlık ve hastalık sırasında antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, immün patofizyoloji anlayışımızı geliştirmenin anahtarı olmaya devam etmektedir. Endojen T hücresi repertuarı içinde antijene özgü T hücresi popülasyonlarının izlenmesinin teknik zorlukları, peptit: MHC tetramer reaktiflerinin geliştirilmesiyle büyük ölçüde ilerlemiştir. Antijenik peptit epitoplarına kompleks oluşturan MHC sınıf I veya sınıf II moleküllerin bu floresan olarak etiketlenmiş çözünür multimerleri, karşılık gelen T hücresi reseptörü (TCR) özgüllüğü ile doğrudan T hücrelerine bağlanır ve bu nedenle, ex vivo tarafından indüklenen fonksiyonel bir yanıta gerek kalmadan antijene özgü T hücresi popülasyonlarını doğal durumlarında tanımlayabilir Uyarım. Son derece nadir popülasyonlar için, tetramere bağlı T hücreleri, tespitin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için manyetik olarak zenginleştirilebilir.

Dokuda yerleşik T hücresi bağışıklığının araştırılması derinleştikçe, lenfoid olmayan dokulara giden ve bu dokularda bulunan antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokolde, fare akciğerlerinde bulunan antijene özgü T hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir talimat seti sunuyoruz. Bu, T hücrelerinin sindirilmiş akciğer dokusundan izole edilmesini, ardından genel bir T hücresi manyetik zenginleştirme adımını ve akış sitometrisi analizi ve sıralaması için tetramer boyamayı içerir. Bu protokolde vurgulanan adımlar, ortak teknikleri ve hazır reaktifleri kullanır, bu da onu fare T hücresi immünolojisi ile uğraşan hemen hemen her araştırmacı için erişilebilir kılar ve akciğerlerde bulunan herhangi bir düşük frekanslı antijene özgü T hücresi popülasyonunun çeşitli aşağı akış analizleri için oldukça uyarlanabilir.

Giriş

Adaptif bağışıklık sisteminin kalbinde, bir T hücresinin belirli bir antijeni tanıma ve ona yanıt verme yeteneği yatar. Bir T hücresinin aynı kökenli antijene ne zaman ve nerede yanıt verdiği, enfeksiyon ve otoimmünite, homeostaz ve kanser, sağlık ve hastalık^{dengesini belirler 1}. T hücrelerinin belirli bir bağışıklık bağlamında çalışmasının, ilgili bir antijen için özgüllüğü olan hücrelere odaklanması gerektiği sonucu çıkar. Antijene özgü T hücresi popülasyonlarını karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde artıran teknolojik gelişmeler arasında, daha çok "peptit:MHC tetramerleri" olarak bilinen, antijenik peptit epitoplarına kompleks haline geti....

Protokol

Bu protokolde açıklanan prosedürler, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir hayvan yönetimi programı olan Massachusetts General Hospital'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylanmış ve geliştirilmiştir. Deneyler, 8-12 haftalık erkek ve dişi fareler üzerinde, belirli patojen içermeyen koşullar altında MGH hayvan tesisinde yetiştirilen ve sürdürülen bir C57BL / 6 genetik arka plan üzerinde gerçekleştirildi.

1. Stok çözeltilerinin hazırlanması

1. 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂

Tartışmalar

Akciğerlerden alınan antijene özgü T hücrelerinin önceki karakterizasyonları, intranazal immünizasyon veya enfeksiyon gibi akut bir hazırlama olayını takiben genişleyen antijene özgü T hücrelerinin sağlam sayılarından yararlanmıştır 20,21,22. Bununla birlikte, kendi kendine antijene özgü T hücreleri veya dokuda yerleşik bellek T hücreleri gibi akciğerlerdeki daha nadir T hücresi popülasyonlarının, .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02