Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Özet

Bu çalışma, iki boyutlu (2D) çizik yara migrasyon testini ve üç boyutlu (3D) küresel filizlenme testini, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya dahil olmak üzere ilgili aşağı akış analiz yöntemleriyle birlikte, in vitro anjiyogenezi incelemek için uygun testler olarak sunmaktadır.

Özet

Anjiyogenez, tümör büyümesi veya neovasküler göz hastalığı dahil olmak üzere vücuttaki hem fizyolojik hem de patolojik süreçlerde çok önemli bir rol oynar. Altta yatan moleküler mekanizmaların ve güvenilir tarama modellerinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, hastalıkların etkili bir şekilde hedeflenmesi ve yeni terapötik seçeneklerin geliştirilmesi için gereklidir. Anjiyogenezi modellemek için çeşitli in vitro testler geliştirilmiştir ve kontrollü bir ortamın anjiyojenik sürücüleri moleküler düzeyde aydınlatmak ve terapötik hedefleri taramak için sağladığı fırsatlardan yararlanılmıştır.

Bu çalışma, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler) kullanılarak in vitro anjiyogenezin araştırılması için iş akışlarını sunmaktadır. 2 boyutlu bir ortamda endotel hücre göçünü ölçen bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanan bir çizik yarası migrasyon testini ve bir kollajen matrisi tarafından sağlanan 3 boyutlu bir ortamda endotel hücresi filizlenmesini değerlendiren küresel filizlenme testini detaylandırıyoruz. Ek olarak, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya da dahil olmak üzere, özellikle 3D ortamda, transkriptomik gibi daha ileri moleküler analizleri mümkün kılmak için numune hazırlama stratejilerini özetliyoruz. Toplamda, bu çerçeve bilim insanlarına in vitro anjiyogenez tahlillerinde bilimsel araştırmalarını sürdürmeleri için güvenilir ve çok yönlü bir araç seti sunar.

Giriş

Önceden var olanlardan yeni kan damarlarının oluşumunu ifade eden^{anjiyogenez 1}, fizyolojik gelişim ve patolojik durumlar sırasında çok önemli bir süreçtir. Retina² veya gelişmekte olan merkezi sinir sistemi³ gibi metabolik olarak aktif dokulara enerji sağlamak ve hasarlı dokunun^{iyileşmesi sırasında 4} vazgeçilmezdir. Öte yandan, anormal anjiyogenez, çok sayıda hastalığın temelidir. Kolorektal kanser veya küçük hücreli dışı akciğer kanseri gibi katı tümörler, anjiyogenezi teşvik ederek büyümelerini ve gerekli enerji tedarikini kolaylaştırır⁵. Kanserin yanı sıra, gelişmiş dünyada körlüğün önde gelen nedenlerini temsil eden diyabetik retinopati veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi gözün neovasküler hastalıkları, anormal damar büyümesinden kaynaklanır ^6,7. Altta yatan patomekanizmanın ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, örneğin vazoproliferatif göz hastalıkları gibi patolojik durumları daha iyi kontrol ederken, yara iyileşmesinde fizyolojik anjiyogenezin nasıl geliştirilebileceğini anlamak için çok önemlidir.

Hücresel düzeyde, vasküler endotel hücreleri, anjiyogenezde çeşitli sinyal molekülleri tarafından aktive edilir, hücre proliferasyonunu ve göçünü başlatır⁸. Hücreler daha sonra bir hiyerarşi halinde organize olur ve çoğalmayan uç hücreleri, gelişmekte olan damar dalının⁸ ön kenarında filopodia oluşturur. Bunun yanı sıra, hızlı çoğalan sap hücreleri, uç hücreleri takip ederek ortaya çıkan damarın oluşumuna katkıda bulunur. Daha sonra, perisitler veya düz kas hücreleri gibi diğer hücre tipleri, yeni ortaya çıkan dalı⁹ daha da stabilize etmek için işe alınır.

Vasküler endotel hücre düzeyinde moleküler süreçleri araştırmak için çok sayıda in vitro protokol geliştirilmiş ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir¹⁰. Bu tahliller tipik olarak iki kategoriye ayrılır: daha basit ancak ölçeklenebilir 2D yaklaşımlar ve daha ayrıntılı 3D protokoller. Yakın tarihli bir projede, farklılıklarının derecesini ve anjiyogenez^12'nin çeşitli yönlerini modelleme yeteneklerini değerlendirmek için 2D çizik yara migrasyon testi ile 3D küresel filizlenme testi¹¹ arasında kapsamlı bir karşılaştırmalı analiz gerçekleştirdik.

Her ikisi de güvenilir ve kolayca uygulanabilir olmanın avantajlarını sunarken, moleküler düzeyde, 3D küresel filizlenme testi, metabolik anahtarlar veya hücre-matris etkileşimleri gibi in vivo verilere kıyasla anjiyogenezin temel yönlerini ele almada olumluydu. İn vitro anjiyogenez testleri, sinyal yolaklarının¹³ anjiyomodülatör potansiyelini değerlendirmek ve terapötik ajanları taramak için kullanıldığından, in vitro sonuçların in vivo ortamlara aktarılabilirliği esastır. Ayrıca, kontrollü koşullar altında anjiyojenik süreçlerin hedeflenen modülasyonuna yanıt olarak moleküler değişiklikleri karakterize etmek için RNA ve protein seviyeleri üzerinde omik tabanlı analizler için fırsat, in vivo ortamlara kıyasla önemli bir fayda olmaya devam etmektedir^14,15.

Bu yayında, transkriptomik analiz için RNA dizilimi ve protein düzeyinde immünohistokimya gibi müteakip moleküler analizler de dahil olmak üzere, canlı hücre görüntüleme migrasyon testi ve sferoid filizlenme testinin kullanılması yoluyla anjiyogenezle ilgili soruları keşfetmek için anahtar testler sunuyoruz.

Protokol

1. HUVEC hücre kültürü

NOT: Aşağıdaki tüm adımları steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) gerçekleştirin.

1. HUVEC'leri genişletme
   1. Her iki anjiyogenez testi için, havuzlanmış insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) veya insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMVEC'ler) kullanın.
   2. Hücreleri, bir bölme gerçekleştirmeden önce endotel hücre büyüme ortamı (EGM) ile kaplanmamış bir T75 şişesinde %90 birleşime ulaşana kadar yetiştirin. Haftada 3 kez orta değişim yapın.
      NOT: Büyümeyi hızlandırmak için ortam günlük olarak değiştirilebilir. HUVEC'leri altıncı pasajın ötesinde kullanmayın. Çalışma, aynı pasajın HUVEC'leri ile yapılan tüm deneyleri yürüterek en tutarlı sonuçları aldı.
2. HUVEC'leri bölme
   1. HUVEC'ler T75 şişesinde istenen birleşmeye ulaştığında, bunları 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez durulayın, ardından hücreleri inkübatörde 2 dakika boyunca% 0.5 tripsin ile inkübe edin.
      NOT: Tripsine uzun süre maruz kalmak HUVEC işlevine zarar verebilir.
   2. Şişeye dokunarak hücreleri yavaşça ayırın. Ters faz kontrast mikroskobu altında başarılı bir şekilde ayrılmayı onaylayın.
   3. 8 mL EGM ekleyin, çözeltiyi bir tüpe aktarın ve hücreleri 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
   4. Hücre sayımı gerekiyorsa, hücreleri 5 mL EGM'de yeniden süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanın. Aksi takdirde, 40 mL EGM ekleyin ve 4 taze T75 hücre kültürü şişesine dağıtın.

2. Çizik yarası migrasyon testi

NOT: Çizik yarası migrasyon testinin tamamlanması için 3 günlük bir süre gerekir (Şekil 1). Aşağıdaki tüm adımları steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) gerçekleştiriniz.

1. Hücrelerin kaplanması ve aç bırakılması (1. gün)
   1. Canlı hücre görüntüleme için özel bir 96 oyuklu plaka kullanarak, oyuk başına 100 μL EGM'de 20.000 HUVEC tohumlayın. Hücrelerin inkübatörde 6 saat oturmasına izin verin.
      NOT: Tedarikçiler ve laboratuvarlar arasındaki değişen vasküler endotel hücre büyüme hızı göz önünde bulundurularak hücre sayılarının optimize edilmesi tavsiye edilir. Amaç, çiziğe başlamadan önce ertesi gün mükemmel bir tek katman elde etmektir. Aşırı nüfuslu kuyucuklar, örneğin temas inhibisyonu¹⁶ ile endotel hücre davranışını değiştirebilirken, eksik bir tek tabaka analizi büyük ölçüde engeller.
   2. %2 FBS ile desteklenmiş kuyu başına 100 μL EBM ile tüm kuyuları gece boyunca aç bırakın.
      NOT: Özellikle çok kanallı bir pipet kullanırken hücre tek tabakasına zarar vermemeye dikkat edin.
2. Stimülasyon solüsyonlarının hazırlanması (2. gün)
   1. % 2 FBS ile desteklenmiş endotel hücre büyümesi bazal ortamında (EBM) istenen maddeleri ve kontrolleri seyreltin. Her kuyucuk için 100 μL çözelti kullanın.
      NOT: %2 FBS ile takviye edilmiş EBM negatif kontrol görevi görürken, 25 ng/mL'de rekombinant insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) pozitif kontrol olarak kullanılabilir. 96 oyuklu plakalar kullanılarak, deneylerin minimum teknik kopyalarla (aynı koşullara sahip 4 kuyu) tasarlanması önerilir, ancak optimum sonuçlar için 8'inin kullanılması önerilmektedir. Düzeni planlarken olası kenar veya köşe etkilerini en aza indirmeye çalışın.
3. Çizik oluşturma (2. gün)
   1. Birleşen bir hücre tek tabakasını ve hücre canlılığını doğrulamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. 96 oyuklu plakayı 96 oyuklu bir yara yapıcı alete yerleştirin ve cihazın kolunu aşağı bastırarak çizik oluşturun. Çift çizilmeyi önlemek için kolu serbest bırakmadan önce yara yapıcı aletin kapağını dikkatlice kaldırın.
   2. % 2 FBS ile desteklenmiş kuyu başına 200 μL EBM kullanarak tüm kuyucukları iki kez yıkayın. Mikroskop altında enkazın başarıyla çıkarıldığını onaylayın.
4. Hücre stimülasyonu (2. gün)
   1. Oyuk başına 100 μL hazırlanan stimülasyon veya kontrol solüsyonu ekleyin.
5. Görüntüleme (2-3. gün)
   1. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu tarafından sağlanan otomatik bir programı kullanarak 24 saate kadar bir süre boyunca saatte bir kez görüntü elde edin.
      NOT: İyi görüntü kalitesi sağlamak için, canlı hücre görüntüleme sistemini barındıran inkübatöre aktardıktan hemen sonra her kuyuyu tarayın. İnkübatörde 30 dakikalık bir alışma süresi, daha iyi bir görüntü kalitesi elde etmeye yardımcı olur. Mikroskop yazılımı, tanımlanan çiziğin orta hattındaki her kuyucuk için saatte bir görüntü elde edecek şekilde programlanmıştır.
6. Bir yara yapıcı alet ve canlı bir hücre görüntüleyici yoksa, aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. Çizilmeye neden olmak için 24 oyuklu bir plakada bir pipet ucu kullanın. Klasik hücre kültürü mikroskobu ile belirli aralıklarla görüntü alın. Bu amaçla, hassas x ve y izleme yetenekleriyle donatılmış motorlu bir mikroskop kullanın. Bu, otomatik konumlandırmayı mümkün kılarak önceden tanımlanmış konumlarda tutarlı görüntü yakalamayı sağlar.
      NOT: Manuel görüntüleme gerektiğinde, tedaviden sadece T0 ve bir zaman noktası 'x' saat sonra görüntülemek uygun bir seçenektir. HUVEC'ler kullanılarak açıklanan protokolde, T12 zaman noktası (stimülasyondan 12 saat sonra), negatif ve VEGF ile uyarılan pozitif kontrol arasında net bir ayrım ile çekici bir zaman noktasıydı. Bununla birlikte, her laboratuvardaki belirli deney ayarları için en uygun zaman noktasını belirlemek için her 2 saatte bir veya 1 saatte bir görüntüleme ile ilk zaman kursu deneylerinin çalıştırılması önerilir.
7. Analiz (3. gün)
   1. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu yazılımı, elde edilen görüntülerin doğrudan analizini sağlayabilir. Hücre çimini, ilk çiziği ve nispi yara yoğunluğu bölgelerini tanımlayan maskeleri tanımlayın. Hücre sınırlarını kontrast farklılıklarına göre belirleyin.
      NOT: HUVEC'lerle yapılan deneyler için 1.6'lık bir segmentasyon ayarı, 500^μm2'lik bir delik dosyası, 1 piksellik ayarlanmış bir boyut, >500 μm'lik bir alan ve >0.6'lık bir eksantriklik kullanılmıştır. Hücre algılama parametrelerinin gerçek görüntülere göre kapsamlı bir şekilde görsel olarak incelenmesi çok önemlidir. Optimize edilmiş konfigürasyonlarla, yazılım zaman içinde bağıl yara yoğunluğunu (RWD) otomatik olarak hesaplar ve teknik kopyaların standart sapması (SD) ile karşılık gelen zamansal grafikler oluşturur. Bu veriler daha sonra istatistiksel analiz için kullanılabilir.

3. 2D ekili hücrelerle RNA ekstraksiyonu

NOT: Steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) adım 3.3'e kadar aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.

1. Kaplama hücreleri (1. gün)
   1. HUVEC hücre kültürü protokolünün 1.2 adımına göre HUVEC'leri ayırın.
   2. Kuyucuk başına 2 mL EGM ile 12 oyuklu bir plakada kuyu başına 50.000 hücre tohumlayın.
   3. 6 saat sonra ortamı, gece boyunca açlıktan ölmek için %2 FBS (açlıktan ölmek üzere olan ortam) içeren EBM'ye değiştirin.
2. Hücrelerin tedavisi (2. gün)
   1. % 2 FBS ile desteklenmiş EBM'ye ilgi gösteren ajanları seyreltin. Açlıktan ölmek üzere olan ortamı hazırlanan seyreltme ile değiştirin ve hücreleri bir inkübatörde istenen süre boyunca inkübe edin.
3. RNA ekstraksiyonu (2-3. gün)
   1. Hücreleri oyuk başına 750 μL Trizol ile parçalayın ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika inkübe edin.
   2. Numuneleri 1000 μL'lik bir pipetle birkaç kez yeniden süspanse edin ve ardından bunları belirli düşük bağlayıcı RNA tüplerinde (hacim 1,5 mL) saklayın. -80 °C'de saklayın.

4. 2D ekili hücrelerle immünositokimya

NOT: Steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) adım 4.4'e kadar aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.

1. Lamellerin hazırlanması
   1. Metanol içinde% 5 potasyum hidroksit içinde 12 mm çapında 100 lamel 50 mL'lik bir tüpte 30 dakika boyunca inkübe edin ve uygulanan çözeltiyi çalkalayın.
      NOT: Bu, lamellerin yüzeyinin protondan arındırılmasında ve kaplama ve kültür koşullarının iyileştirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu noktada, lamellerin ortam içinde iyi dağıldığından ve kurumadığından ve birbirine yapışmadığından emin olunması şiddetle tavsiye edilir.
   2. Lamelleri demineralize su ile 30 dakika boyunca 4 kez yıkayın.
   3. Yıkadıktan sonra, saklamak için% 70 izopropil çözeltisine aktarın.
2. Lamellerin kaplanması
   1. İzopropil alkolün buharlaşmasına izin vermek için lamelleri kare bir Petri kabının duvarına ayrı ayrı yaslayın.
   2. 5 dakika sonra, lamelleri 24 oyuklu bir plakaya aktarın (oyuk başına bir lamel). Her bir kuyucuğa PBS'de 10 mg / mL kollajen I çözeltisinden 1 mL uygulayın ve 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
   3. Daha sonra lamelleri PBS ile 4-5 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
3. Yetiştirme hücreleri
   1. HUVEC hücre kültürü protokolünün 1.2 adımında belirtilen prosedürleri izleyerek HUVEC'leri ayırın.
   2. Oyuk başına 2 mL EGM ile 24 oyuklu bir plakada kuyu başına 50.000 hücre tohumlayın.
   3. 6 saat sonra, hücrelerin kuyuya yapışmasına ve hücreleri gece boyunca aç bırakmasına izin vermek için ortamı %2 FBS içeren EBM olarak değiştirin.
   4. Ertesi gün,% 2 FBS ile desteklenmiş EBM'ye ilgi gösteren ajanları seyreltin. Kuyucuklardaki açlık çözeltisini hazırlanan seyreltme ile değiştirin ve hücreleri bir inkübatörde istenen süre boyunca inkübe edin.
4. Sabitleme ve engelleme
   1. Hücreleri istenen süre boyunca yetiştirin, ardından hücreleri PBS ile 5 dakika yıkayın.
   2. Hücreleri %2 paraformaldehit (PFA) ile PBS'de oda sıcaklığında (RT) 20 dakika sabitleyin.
   3. PBS ile 3-4 kez 5 dakika yıkayınız.
   4. Numuneleri% 5 normal keçi serumu (NGS),% 0.1 Triton-X-100 içeren bloke edici tampon ile RT'de 1 saat boyunca PBS'de inkübe edin.
      NOT: Bu adımda, PFA'nın tamamen çıkarılmasını garanti etmek için numunelerin yıkanması önemlidir. İkincil antikorun kökenine göre serum türünü seçin.
5. Boy -ama
   1. Numuneleri, birincil antikor ile bloke edici tamponda gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   2. Ertesi gün, bağlanmamış herhangi bir primer antikoru çıkarmak için, numuneleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3-4 kez yıkayın.
   3. Daha sonra, numuneleri, bloke edici tampon içinde birlikte seyreltilmiş karşılık gelen ikincil antikor ve Phalloidin-FITC ile RT'de 1 saat inkübe edin.
   4. 3-4 kez daha yıkayın.
   5. Lamelleri küçük bir damla DAPI içeren montaj ortamı ile slaytların üzerine ters çevirin, karanlıkta kurumasını bekleyin ve oje ile kapatın. Numuneleri karanlıkta 4 °C'de saklayın.

5. Küresel filizlenme deneyi

NOT: Küresel filizlenme testinin tamamlanması için 3 gün gerekir (Şekil 2). Steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) adım 5.7'ye kadar aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.

1. Asılı damlalarda sferoidlerin oluşturulması (1. gün)
   1. HUVEC hücre kültürü protokolünün 1.2 adımında belirtilen prosedürleri izleyerek HUVEC'leri ayırın.
   2. 200.000 hücreyi 8 mL EGM ve 2 mL metosel stok çözeltisi ile birleştirin ve iyice karıştırın. Metosel stok çözeltisinin hazırlanmasına ilişkin talimatlar için lütfen Ek Dosya 1'e bakın.
   3. Çözeltinin 25 μL damlacıklarını büyük, kare bir Petri kabının ters çevrilmiş iç yüzeyine dağıtın. Kapağı yavaşça 180° döndürün ve damlacıklar asılı kalacak şekilde hücre kültürü kabının altına yerleştirin. Kabı gece boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
2. Kollajen jeli hazırlayın (2. gün)
   1. 2.3 mL sıçan kuyruğu kollajen tip I'i 0.280 mL 10x Medium 199 ile karışım sürekli olarak eşit sarı bir renk tonu elde edene kadar iyice karıştırın. Bu karışımı tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.
3. Kollajen jeli titre edin (2. gün)
   1. NaOH (2 N) kullanarak turuncu renkle gösterilen fizyolojik bir pH elde etmek için karışımı titre edin.
   2. Nihai ürüne 50 μL HEPES tamponu ekleyin.
      NOT: Test için en uygun dinamik aralığı sağlamak için, fizyolojik bir pH'a mümkün olduğunca yakın bir şekilde yaklaşmak zorunludur. Çeşitli kollajen partileri farklı miktarlarda NaOH gerektirebilir. Karışımı işlem boyunca kesinlikle buz üzerinde tutun ve her zaman homojen bir şekilde karıştırın.
4. Sferoidlerin toplanması (2. gün)
   1. Hücre kültürü kapaklarından asılı damlaları 20 mL PBS ile durulayın.
   2. Çözeltiyi 250 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve tüpe hafifçe vurarak sferoidleri 0.1 mL FBS ve 0.4 mL EGM'de yeniden süspanse edin.
   3. 2 mL metosel stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Sferoidlere zarar vermemek için minimum 5 mL kapasiteli bir pipet kullanın.
5. 3D kollajen matrisine sferoidlerin eklenmesi (2. gün)
   1. Hazırlanan kollajen karışımından 2 mL yeniden süspanse edilmiş sferoidlere ekleyin ve iyice karıştırın.
   2. Elde edilen karışımın 0.5 mL'sini 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına dağıtın ve 30 dakika boyunca bir hücre inkübatörde inkübe edin.
6. 3D kollajen matrisinde sferoidlerin uyarılması (2. gün)
   1. EBM'de istenen maddelerin seyreltilmesini hazırlayın. Her kuyucuk için 100 μL çözelti kullanın.
      NOT: EBM negatif kontrol görevi görürken, 25 ng/mL'de (500 μL kollajen matrisi ve 100 μL EBM tabakasındaki nihai konsantrasyon) vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
   2. İstenilen süre boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: Standart bir tahlilde 18-24 saat önerilir, ancak zamanlamanın her laboratuvarda dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekir.
7. Görüntüleme sferoidleri (3. gün)
   1. Kuyu kenarıyla, birbiriyle temas halinde olmayan veya hasar belirtileri gösteren tüm sferoidlerin görüntülerini yakalamak için ters çevrilmiş bir mikroskop ve görüntüleme platformu kullanın. Tüm koşullarda tutarlı ayarları ve yakınlaştırma düzeylerini koruyun.
8. Analiz (3. gün)
   1. Her görüntüdeki her bir sferoidden gelen tüm filizlerin uzunluğunu belirlemek için ImageJ Fiji'deki ölçüm aracını kullanın.
      NOT: Analizi daha verimli hale getiren ve bir çıktı .txt dosyası oluşturan Ek Dosya 2'de sağlanan eklentiyi kullanın.
   2. Verileri bir elektronik tabloya, R'ye veya tercih edilen başka bir yazılıma aktarın ve her koşul için okuma olarak sferoid başına tüm filizlerin ortalama kümülatif uzunluğunu kullanın.
      NOT: Farklı jellerden elde edilen sonuçlar, mutlak filizlenme uzunlukları şeklinde birleştirilemez. Verilerin birleştirilebilmesi için her bir tedavi grubundan gelen verilerin EBM veya VEGF kontrol grubuna (nispi filizlenme uzunluğu) normalleştirilmesi gerekir.

6. 3D ekili hücrelerle RNA ekstraksiyonu

1. Küresel filizlenme testi
   1. Küresel filizlenme testini bölüm 5'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. Kollajen jeli lizisi
   1. Sferoid jelleri ılık PBS ile 5 dakika yıkayın.
   2. Küresel jelleri dörde bölün ve 4 çeyreği de 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Jellerin mekanik diseksiyonu için bir neşter kullanın.
   3. Jel örneklerini lizis çözeltisi (PBS'de 2 mg / mL Kollajenaz D içeren) ile muamele edin ve bir çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
   4. Lizis tamponunun reaksiyonunu durdurmak için jelleri 2 mM EDTA ile desteklenmiş PBS ile nazikçe yıkayın.
3. RNA ekstraksiyonu
   1. Parçalanmış jelleri 750 μL Trizol içinde yeniden süspanse edin ve adım 3.3'te açıklandığı gibi yeterli RNA ekstraksiyonunu garanti etmek için 10 dakika inkübe edin.
   2. Numuneleri 1000 μL'lik bir pipetle birkaç kez yeniden süspanse edin ve numuneleri belirli düşük bağlayıcı RNA tüplerine (hacim 1,5 mL) aktarın. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

7. 3D kollajen matrisindeki sferoidlerin immünositokimyası

1. Küresel filizlenme testi
   1. Küresel filizlenme testini bölüm 5'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. Sabitleme ve engelleme
   1. Jelleri PBS'de% 4 PFA ile 1 saat sabitleyin.
      NOT: Jel içindeki hücrelerin iyi bir şekilde sabitlenmesini sağlamak için, PBS ile durulamayı takiben jellerin kuyucukların kenarlarından bir neşter ve cımbızla dikkatlice ayrılması gerekir.
   2. Jeleri PBS ile 3-4 kez nazikçe yıkayın ve ardından kuyucukların yüzeyinden tamamen ayırın ve yeni 24 oyuklu plakalara aktarın.
   3. Jelleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde bloke edici solüsyon (PBS'de %5 NGS ve %0.1 Triton-X-100 içeren) ile RT'de 1 saat inkübe edin.
3. Boy -ama
   1. Numuneleri gece boyunca 4 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin ve birincil antikor bloke edici tamponda seyreltilir.
      NOT: Bu inkübasyon sırasında jelleri çevirmek boyama kalitesini iyileştirmedi.
   2. Ertesi gün, jelleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 4-5 kez nazikçe yıkayın.
   3. Phalloidin-FITC ile seyreltilmiş karşılık gelen ikincil antikoru, bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tamponda inkübe edin.
   4. PBS ile 4-5 ek yıkama adımı gerçekleştirin.
   5. Jelleri mikroskop lamlarına aktarın ve her bir jelin üzerine yerleştirilmiş bir lamel üzerine iki damla DAPI içeren montaj ortamı ile monte edin. Oje ile kapatmadan önce numunelerin kurumasını bekleyin ve karanlıkta 4 °C'de saklayın.
4. Mikroskopi
   1. Tüm örnekleri konfokal bir mikroskopta görüntüleyin. 20x reklam verme amacını kullanın ve ilgilendiğiniz bölgeye odaklanın. Görüntüleri Z yığınları olarak ve tek tek odak düzlemi görüntüleri olarak elde edin.
      NOT: 3D numune boyunca birden çok bölümde Z yığını ve odak düzlemi görüntülerinin elde edilmesi, özellikle kalın 3D numuneler için tam temsili yakalamak için çok önemlidir.

8. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMVEC'ler)

NOT: Açıklanan tüm adımlar, örneğin insan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMVEC'ler) gibi mikrovasküler endotel hücreleri ile de gerçekleştirilebilir. Bu durumda, besiyerinin yetiştirme için %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren spesifik bir mikrovasküler endotel hücre ortamına ve ayrıca her tahlilde spesifik adımlara geçirilmesi gerekir. Tahlil protokollerinde HRMVEC'e özgü farklılıklar aşağıda özetlenmiştir:

1. Çizik yara tahlili
   1. Hücreleri EGM yerine% 10 FBS mikrovasküler endotel hücre ortamında yetiştirin.
   2. 20.000 hücre / kuyu tohumu.
   3. Hücreleri gece boyunca aç bırakmayın.
   4. Çizik işlemini gerçekleştirdikten sonra, ortamı %2 FBS'li EBM yerine %5 FBS içeren bazal endotel hücre ortamına değiştirin.
2. 2D ekili HRMVEC'lerin immünositokimyası
   1. Hücreleri EGM yerine% 10 mikrovasküler endotel hücre ortamında yetiştirin.
   2. Hücreleri gece boyunca aç bırakmayın.
   3. Tedaviden hemen önce ortamı EBM +% 2 FBS yerine EBM +% 5 FBS olarak değiştirin.
3. Küresel filizlenme testi
   1. EGM yerine %10 FBS içeren mikrovasküler endotel hücre ortamı ile hücreleri asılı damlalar halinde tohumlayın.
4. 3D kollajen matrisindeki sferoidlerin immünositokimyası
   1. EGM yerine %10 FBS içeren mikrovasküler endotel hücre ortamı ile hücreleri asılı damlalar halinde tohumlayın.

Sonuçlar

Migrasyon tahlili için, tam olarak oluşmuş bir hücre tek tabakasının varlığının sistem tarafından doğru bir şekilde tespit edildiğinden emin olmak için t = 0 saat zaman noktasında yakalanan görüntülerin kapsamlı bir şekilde incelenmesi çok önemlidir (Şekil 1B). Ek olarak, çizik kenarlığının netliği ve düzlüğü onaylanmalıdır (Şekil 1B). Hücresiz alan büyük ölçüde döküntülerden arındırılmış olmalıdır. Testin son...

Tartışmalar

Bu yazıda, in vitro anjiyogenezi incelemek için fonksiyonel ve moleküler okumaları olan bir teknik spektrumu sunduk.

Migrasyon testi, ıslak laboratuvar çalışmasının tüm alanlarında kullanılan iyi bilinen bir tekniği temsil eder. Tarama ve doz-yanıt deneyleri için uygun 96 oyuklu formattan, WoundMaker aracı tarafından oluşturulan standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir yara boyutundan, 24 saate kadar hızlandırılmış görüntüleme yoluyla migrasyon kinetiğ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493