Çörek Otu Yağı Yüklü, Aljinat Esaslı, pH Duyarlı Boncukların Elektropüskürtme Tekniği Kullanılarak Sentezi

Özet

pH'a duyarlı, tek tip mikro boncuklar üretmek için yüksek elektrik voltajı ve hedeflenmiş, aktif bileşen yüklü bir emülsiyon kullanan bir teknik sunulmaktadır.

Özet

Çörek otu bitkisinin tohumlarından elde edilen çörek otu yağı (BSO), özellikle kolon kanseri bağlamında potansiyel anti-kanser özellikleri nedeniyle dikkat çekmiştir. Aktif bileşiği timokinon, kanser hücresi büyümesini inhibe etmeye ve kolon kanseri hücrelerinde apoptozu indüklemeye yardımcı olabilir. Ek olarak, çörek otu yağının anti-inflamatuar ve antioksidan etkileri, daha sağlıklı bir bağırsak ortamına katkıda bulunabilir ve potansiyel olarak kanser riskini azaltabilir. Bu nedenle, bu çalışma, ilacı pH 1.2'de (mide) serbest bırakmadan kontrollü bir şekilde kolona BSO'yu iletmek için pH'a duyarlı aljinat boncukları sentezledi, böylece pH 6.8'de iyi tanımlanmış bir salım modeli sağladı. Elektrosprey teknolojisinin kullanımı, gastrointestinal ortamda daha yüksek şişme ve difüzyon oranına sahip küçük, homojen boncukların formüle edilmesini kolaylaştırarak proses performansını iyileştirir.

Formüle edilen boncuklar, ex-vivo mukoadezif mukavemet testi, boncuk boyutu, küresellik faktörü (SF), kapsülleme verimliliği (EE), taramalı elektron mikroskobu (SEM), in vitro şişme davranışı (SB) ve asidik ve tampon ortamlarda in vitro ilaç salınımı ile karakterize edildi. Üretilen tüm bu boncuklar, bu testte 0,58 ± 0,01 mm'lik mütevazı boyutlar ve 0,03 ± 0,00 mm'lik küresel şekil gösterdi. Formülasyon, in vitro olarak umut verici yüzer ve serbest bırakma özellikleri gösterdi. Çok düşük bir kümülatif boncuk yüzdesi ile,% 90.13 ±% 0.93'lük yağ EE yüksekti ve salım çalışması, midede iyi yüzen doğa ile pH 6.8'de% 90'dan fazla gösterdi. Ek olarak, boncuklar bağırsak boyunca eşit aralıklarla yerleştirildi. Bu protokolde kullanılan elektropüskürtme yaklaşımı tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar verir. Bu nedenle, bu protokol ticarileştirme amacıyla büyük ölçekli üretim için kullanılabilir.

Giriş

Çörek otu ve özellikle BSO, köklü tıbbi özellikleri nedeniyle çok çeşitli hastalıkları tedavi etmek için çağlar boyunca kullanılmaktadır. Timokinon belki de BSO^1'de bulunan en önemli fitokimyasallardan biridir. Son yıllarda, araştırmacılar timokinonun potansiyel terapötik faydalarını in vivo ve in vitro olarak incelediler ve BSO kullanımını desteklemek için ampirik kanıtlar ürettiler. Egzama, yüksek tansiyon, astım, öksürük, baş ağrısı, grip, ateş, antikanser, baş dönmesi ve aktivite gibi semptomları tedavi etmek için kullanılabilen BSO için antihipertansif, antibakteriyel, antihistaminik, antifungal, analjezik, antidiyabetik, lipid düşürücü ve antienflamatuar özelliklerin tümü bu çalışmalarla gösterilmiştir ^2,3.

Küçük sıvı ve dispersiyon damlacıkları veya katı malzeme parçacıkları üzerine nispeten ince kaplamaların uygulanması, mikrokapsülleme olarak bilinir. Yağ söz konusu olduğunda, mikrokapsüllenmiş yağ genellikle oldukça değerlidir, çünkü BSO gibi bazı yağ türleri besleyici gıdalar olarak kabul edilir ve tıbbi avantajlar sunar⁴. Bununla birlikte, yağların doğrudan gıdanın matrisine eklenmesi buharlaşmaya yol açabilir, bu da oksijen ve UV ışığına maruz kalmanın bir sonucu olarak faaliyetlerin hızla kaybolmasına neden olabilir⁵. Ayrıca, yağların salınım hızı üzerindeki kontrol eksikliği, ani ve geçici bir etkiye neden olur. Mikrokapsülleme veya mikrosferleştirme yoluyla uçucu yağın etrafında polimerik bir kaplama oluşturmak, bu dezavantajları aşmanın bir yöntemidir⁶.

Mikroküreler olarak da bilinen mikrokapsüller, yağları zararlı çevre koşullarından korur⁷. Bu işlem, ilaç etkinliğini artırmak, ilaç içeriğini korumak, zaman salınımlı tabletleri etkinleştirmek, tat maskelemesini iyileştirmek, ürün raf ömrü boyunca lezzet kaybını azaltmak, ağız hissini uzatmak ve uyumsuz bileşenleri tek bir dozajda ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır⁸. Mikroenkapsülasyon ayrıca metabolik emilimin korunmasına, yağ salınım hızının kontrol edilmesine ve belirli bir yerde amaçlanan sonucu elde etmek için uygun konsantrasyonların korunmasına yardımcı olur⁹.

Elektro-hidrodinamik kapsülleme, basit ve uyarlanabilir bir yöntemdir. Aktif madde, bir dış kabuktan oluşan bir mikrokapsülün iç çekirdeğine yerleştirilmiştir. Bu bağlamda, aktif bileşenin açıkça tanımlanmış bir çekirdekten ziyade daha etkili bir şekilde yayılabilmesini garanti etmek için oldukça güçlü bir matrise sahiptir. Küresikliasyondan önce, mikro küreleri⁹ üretmek için aktif madde ve polimer çözeltisi birleştirilmelidir. Öte yandan, yağ uçucu olduğu için mikro kapsülleme son derece zor olabilir ve dikkatli bir sıcaklık kontrolü gerektirir.

Yağları kapsüllemek için çeşitli yöntemler vardır. Örneğin, biyoaktif bileşenlerinin parçalanmasını veya buharlaşmasını önlemek için bazı yağların düşük sıcaklıklarda kapsüllenmesi gerekir. Mikro ve nano boyutlu yapılar oluşturmak için, elektrohidrodinamik atomizasyon (EHDA) araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmiştir¹⁰. Bu anlamda, akış hızı, uygulanan voltaj ve nozul boyutunun yanı sıra polimerik çözeltinin toplama mesafesi özelliklerini içeren işleme koşulları, istenen partikül boyutunu veya morfolojisini üretmek için dikkate alınması gereken iki temel faktördür^11,12.

Bu araştırmada, BSO'yu kapsüllemek için aljinatlar - oral yutmaya uygun doğal olarak oluşan bir polisakkarit türü - kullanıldı. Kahverengi deniz yosunları, doğal olarak oluşan anyonik bir polimer olan aljinat içerir. İki monomerik yapıdan oluşur: α-L-guluronik (G) ve 1-4βD-mannuronik (M) asit¹³. Polimeri toksik değildir¹⁴, yüksek derecede biyouyumluluğa sahiptir, ucuzdur ve etkili bir şekilde bozunur¹⁵. Bu nedenle biyoteknoloji ve mühendislik sektörlerinde sıklıkla kullanılmaktadır.

Aljinatlar, Sr²⁺, Ca²+ veya Zn²+ iyonları gibi iki değerlikli katyonlarla iyonik bağlantılar oluşturarak çeşitli aljinat zincirlerinin G grupları arasında çapraz bağlı bir yapı oluşturabildikleri için iyonik jelleşme ile kapsülleme için tercih edilen malzemedir. Jelleşme işlemi, iki değerlikli katyonu yan yana aljinat molekülleri üzerindeki iki karboksil grubuyla sınırlayan yumurta kutusu modeli ile yeterince karakterize edilebilir. Sodyum aljinat boncuklarının hidrojel özelliklerinin makromoleküllerin ve küçük moleküllerin salınımını düzenleyebileceği öne sürülmüştür. Sodyum aljinat boncukları, muko-yapıştırıcı nitelikleri nedeniyle bağırsak mukozasına uzun süre yapışabilir. Ayrıca aljinat, yağları asidik ortam¹⁶ gibi dış elementlerden koruyabilen ve yağları gastrointestinal sistemin¹⁷ dağıtım kanallarına aktarabilen bir kalkan sunar. O zamandan beri, ilacın mukozal dokulara bölgeye özgü uygulanmasına yardımcı olmak için araştırmalarda kullanılmıştır^18,19.

Bu çalışmada, emülsifiye edici ticari yağların kapsül²⁰ oluşturmak için uygulanabilirliğini araştırmak için elektro-hidrodinamik yaklaşım kullanılmıştır. Burada, aljinat-BSO yüklü mikroküreler²⁰ oluşturmak ve analiz etmek için elektro-hidrodinamik yaklaşım kullanılmıştır. Bu çalışma, mikrokürelerin SF, ex-vivo, muko-adeziv özellikleri, EE%, fiziksel görünüm, boyut dağılımı ve zeta potansiyeli dahil olmak üzere bir dizi başka faktörü değerlendirdi; kimyasal uyumluluğu test etmek için zayıflatılmış toplam yansıma-Fourier dönüşümü kızılötesi (ATR-FTIR) spektroskopisi^{kullanıldı 20}.

Protokol

1. Aljinat-BSO emülsiyonunun hazırlanması

1. 50 mL'lik bir beherde %1, 3 ve %5 w/v lesitin içeren %1 w/v sodyum aljinat çözeltisi içinde %10 w/v BSO'yu dağıtın.
2. Ultrasonik homojenizatör kullanarak bir nano emülsiyon elde edin. Güç seviyesini %20 olarak ayarlayın. İşlemi tamamlamak için başlat düğmesine tıklayarak homojenizatörü 55 saniye boyunca çalıştırın.

2. Aljinat-BSO emülsiyonunun karakterizasyonu

1. Zeta potansiyelini ve partikül boyutu dağılımını analiz edin
   1. Taze hazırlanmış emülsiyonun 0.1 mL'sini 25 mL'lik bir cam beherde alın ve 9.9 mL damıtılmış su ile seyreltin.
   2. Bu seyreltilmiş çözeltinin 2,5 mL'sini 3 mL'lik bir kuvars küvete alın ve küveti bir ölçüm odasına yerleştirin.
   3. Kapağı açın ve küveti cihazın içine yerleştirin, küvetin ışık huzmesinin yoluna göre doğru yönlendirildiğinden emin olun. Ölçüm simgesini tıklayın.
   4. Küveti çıkarın. Numuneyi alın veya uygun şekilde atın.
   5. Verileri daha sonra kullanmak üzere kişisel bir klasöre pdf dosyası olarak kaydedin.
2. Emülsiyon stabilitesini (ES) belirleyin
   1. 10 mL santrifüj tüplerinde 5 mL taze hazırlanmış emülsiyonu alın. Emülsiyonları (n = 3) 894 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   2. Denklemi (1) kullanarak, faz ayırma arayüzü konumuna göre ES'yi belirleyin.
      (1)
      Burada Vemul, santrifüjlemeden sonra kalan emülsiyonun hacmidir ve Vinitial, ilk emülsiyonun hacmidir.
3. Boncuk hazırlama
   1. BSO aljinat boncukları
      1. EHDA adı verilen elektrosprey tekniğini kullanarak BSO aljinat boncukları hazırlayın. %10 BSO, %1 sodyum aljinat ve %3 lesitin çözeltisinden oluşan hacimce ağırlık (w/h) BSO emülsiyonu kullanın).
      2. Akış hızını düzenlemek için bir şırınga pompası kullanarak, emülsiyonu 10 mL'lik bir plastik şırıngaya yükleyin ve 22 G'lik bir iğneden itin. İğne ucunu yüksek voltajlı bir güç kaynağının pozitif elektroduna takın.
      3. Toplayıcı olarak, içinde 50 mL %1 w/w kalsiyum klorür (jelleşme banyosu) bulunan topraklı bir beher kullanın. Kalsiyum klorür çözeltisinin yüzeyinin üzerinde 1 cm'lik bir mesafeyi korurken 3, 3 ve 5 kV'luk voltajlarda 7 mL/dk ile 10 mL/dk arasında damlama akış hızını değiştirin.
      4. Tam jelleşmeyi doğrulamak için, boncukları çalkalarken jelleşme banyosunda 30 dakika bekletin. Boncukları jelleşme banyosundan çıkarmak için paslanmaz çelik bir filtre kullanın ve toplanan boncukları ultra saf damıtılmış suyla yıkayın.
      5. Boncukları bir laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında 16 saat kurumaya bırakın. Boncukların yüzde verimini hesaplamak için Denklem (2) kullanın.
         (2)
   2. BSO içermeyen aljinat boncuklar
      1. % 1 w / v sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın. Çözeltiye %1, %3 ve %5 w/v konsantrasyonlarında lesitin ekleyin. Lesitin tamamen eriyene kadar çözeltiyi iyice karıştırın.
      2. Adım 2.3.1.2-2.3.1.5'te açıklandığı gibi BSO içermeyen aljinat boncukları hazırlamak için adım 2.3.2.1'deki çözümü kullanın. Denklem (2) kullanarak verimi hesaplayın.

3. Boncuk karakterizasyonu

1. Boyut ve şeklin belirlenmesi
   1. Boncukların boyutunu ve şeklini belirlemek için bir görüntü analizörü kullanın. Islak ve kurutulmuş boncukların dijital kamerasını kullanarak fotoğraf çekin.
   2. Ardından, cihazın önceden yüklenmiş ölçek çubuğunu kullanarak boncuk çapını ölçün. Çap değerlerini kullanarak, denklem (3) kullanarak elde edilen çap değerlerinden SF'yi hesaplayın:
      SF = (3)
      burada Dmax, bir boncuğun merkezinden geçen en büyük çapı (mm cinsinden) temsil ederken, Dper, Dmax'a dik olan ve boncuğun merkezinden geçen çapı (mm cinsinden) ifade eder.
      NOT: Sıfırlık bir SF, ideal olarak küresel bir boncuk anlamına gelir ve artan SF değerleri, küresel bir şekilden daha fazla sapmayı gösterir. Ayrıca, SF'leri 0,05 veya daha düşükse boncuklar küresel olarak kabul edilir.

4. EE% tayini

1. Boncukları emülsiyona geri döndürmek için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde parçalayın. Elde edilen emülsiyonun absorbansını bir UV-vis spektrofotometresi kullanarak 600 nm'de ölçün.
2. Emülsiyonun bulanıklığını temsil etmek için absorbans değerini kullanın. Emülsiyonda bilinen bir miktarda BSO kullanarak standart bir eğri oluşturun.
3. Denklem (4) kullanarak EE%'yi hesaplayın:
   (4)

5. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)

NOT: BSO aljinat boncuklarının mikro yapısını ve yüzey morfolojisini gözlemlemek için SEM kullanın.

1. Kurumuş boncukların içini incelemek için birkaç tanesini kesin. Kesilen boncukları alüminyum saplamaların üzerine yerleştirin ve karbon yapışkan bantlar kullanarak yapıştırın.
2. Boncukları bir argon atmosferinde bir vakumlu buharlaştırıcıda bir karbon püskürtme modülü ile püskürtün. Karbon kaplama için 100 şve 50 şkalınlık uygulayın.
3. 10 kV ile 15 kV arasında bir voltaj hızlandırıcı ile yüksek vakumda kaplanmış boncukların görüntülerini elde edin.

6. ATR-FTIR kullanarak ilaç-eksipiyan etkileşimini belirleyin

1. Ortam havasını arka plan olarak ve 1 ^cm-1 çözünürlüğü kullanarak alet dalga sayılarını 4.000 cm⁻1 ile 400 cm⁻1 arasında ayarlayın. Ek Dosya 1'e bakın.
2. BSO, sodyum aljinat, lesitin, kalsiyum klorür, BSO içermeyen boncuklar, aljinat-BSO boncukları ve aktif bileşen ve yardımcı maddelerin (sodyum aljinat, lesitin, kalsiyum klorür ve BSO) fiziksel karışımının spektrumlarını ayrı ayrı kaydedin.
   1. Numuneyi (5-10 mg) numune alma alanına yerleştirin. 20 taramayı, çözünürlüğü 4'ü, gösterge kuvvetini 80'i, düz uçlu baskı kolunu ayarlayın. Spektrumun otomatik olarak istenen klasörde saklanması için Otomatik Artış'ın Boş seçeneğine ayarlı kaldığını doğrulayın.
   2. Numune ölçümüne başlamak için [Sample] düğmesine tıklayın. [Numune]'yi seçtikten sonra, bekleme süresi olmadığından, numunenin hazır olduğundan ve basınç kelepçesinin azaltıldığından emin olun. Tüm örnekleri ayrı ayrı analiz edin. Spektroskopi yazılımı kullanarak kaydedilen tüm spektrumları ayrı ayrı analiz edin.

7. Diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC)

NOT: BSO yüklü boncukların termal özellikleri ve uyumluluğu DSC (Ek Dosya 1) kullanılarak araştırılmıştır.

1. Normal bir alüminyum tavada ~ 3.20 mg ağırlığındaki boncukları kapatın. Numuneleri, 20 L/dk hızında akan bir nitrojen akışı altında 50-350 °C sıcaklık aralığında analiz edilirken 10 °C/dk hızında ısıtın.

8. Boncukların şişme özellikleri

1. 100 mg kurutulmuş aljinat-BSO boncuk hazırlayın.
2. Simüle edilmiş bağırsak sıvısını (SIF) ve simüle edilmiş mide sıvısını (SGF) uygun boyutta temiz, kuru bir karıştırma kabında hazırlayın - 6 L, 10 L veya 25 L Gerekli hacmin yaklaşık% 33'üne arıtılmış su ekleyin -2 L, 3 L veya 8 L ve konsantre şişesinin içeriğini kaba aktarın. Şişeyi arıtılmış suyla durulayın ve gerekli hacmi elde etmek için durulamaları ve arıtılmış suyu karıştırma kabına ekleyin; İyice karıştırın. PH'ı ölçün ve spesifikasyon dahilindeyse devam edin; gerekirse pH'ı ayarlayın.
3. Boncukları, simüle edilmiş bağırsak sıvısı (SIF) ve simüle edilmiş mide sıvısı (SGF) içeren 50 mL ortama batırın. Koşulları 37 ± 0,5 °C'de 2 saat koruyun.
   1. Şişirilmiş boncukları çıkarın ve 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ve 120 dakika veya daha fazla önceden tanımlanmış aralıklarla metal bir ağdan süzün. Şişmiş boncuklardan fazla sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havlu kullanın.
   2. Elektronik analitik terazi kullanarak silinen boncukların ağırlığını ölçün. Denklem (5) kullanarak şişme indeksi yüzdesini (%SI) belirleyin:
      (5)

Sonuçlar

BSO yüklü aljinat mikro boncukların hazırlanması
Şekil 1, BSO yüklü aljinat mikro boncukları hazırlamak için deney kurulumunu temsil etmektedir. Kullanılan lesitin miktarı, BSO emülsiyonunun stabilitesi üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Her üç lesitin konsantrasyonu ile yapılan emülsiyonlar nispeten stabildi. Bu deneyde emülsiyon^20'nin stabilitesini değerlendirmek için santrifüjleme yönt...

Tartışmalar

EHDA işlemi kullanılarak, pH'a duyarlı bir taşıyıcı olarak BSO yüklü aljinat mikro boncuklar oluşturuldu. Boncuk ağı, bol miktarda karboksilik asit grubunun varlığına bağlı olarak pH'a bağlı şişme ve ilaç salma davranışı sergiledi. Polimer zincirleri arasındaki güçlü moleküller arası hidrojen bağının, pH 1.2'de BSO yüklü boncukların azalmış şişme karakterinin arkasındaki neden olduğu ortaya çıktı. BSO yüklü boncuklar, pH'a duyarlı ilaç uy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Centrifuge Tubes	Globe Scientific	22-171-624
22 G needle	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	CAD4172
3 mL quartz-cuvette	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	Z276669
50 mL beaker
Aluminum stubs
An electronic analytical balance
ATR-FTIR	Bruker Malaysia Sdn Bhd, Kawasan Perindustrian Temasya, 40150 Shah Alam, Selangor, Malaysia.
Black seed oil	IKOP Pharmaceutical Ltd. (IKOP, Faculty of Pharmacy, IIUM, 25200 Kuantan, Pahang, Malaysia	B182111	Active ingredient
Calcium chloride dehydrate, CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	21074	Gelling agent
Carbon adhesive tapes
Centrifuge
Differential scanning calorimetry
Digital   camera
Grounded beaker
High guluronic acid content Sodium alginate (mw. 97,000) with medium viscosity (40 – 100 mPa s)	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W201502	Polymer
High voltage power supply
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W292912	ATR-FTIR cleaning purpose
Lecithin	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	P7568	Surfactant
Microscope
Paper towel
Scanning electron microscopy
Simulated gastric fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	1651	Release media and swelling media
Simulated intestinal fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	84082-64-4	Release media and swelling media
Spectroscopy software
Stainless-steel filter
Syringe pump	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Ultrapure distilled water	Supplied by institutional lab
Ultrasonic homogenizer	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
UV-vis spectrophotometer.
Vacuum evaporator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Voltage accelerator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Zetasizer Nano-ZS	(Malvern Zetasizer Nano series Nano-S and Nano-Z, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)