JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyarabileceğini ve yan popülasyon (SP) hücre tespiti için 355 nm lazere uygun bir alternatif olarak hizmet edebileceğini ve böylece akış sitometrisi uygulamalarında mevcut lazer yelpazesini genişletebileceğini gösteriyoruz.

Özet

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. Hoechst SP yöntemi, ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının boya akış özelliklerine dayalı olarak kök hücrelerin izolasyonu için kullanılır. Yöntem başlangıçta hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) tanımlanması ve izolasyonu için kullanıldı, ancak şimdi öncelikle kanser kök hücrelerinin (CSC'ler) tanımlanması ve izolasyonuna odaklanmak için gelişti. FCM'nin geleneksel algılama yöntemi, SP hücrelerini tespit etmek için boyayı uyarmak için 355 nm'lik bir lazer kullanır. Bu çalışma sayesinde, 355 nm lazer kullanarak SP hücrelerinin tespitinin yerini alabilecek boya uyarımı için alternatif yaklaşımları başarıyla belirledik. Bu, yüksek güçlü 375 nm veya 405 nm lazerlerin kullanılmasıyla elde edilir. Bu, yalnızca 355 nm lazer akış sitometrisi ile sınırlı kalmak yerine, SP hücrelerinin tespitinde gelişmiş seçicilik uygulamamıza izin verir.

Giriş

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. SP hücreleri, floresan DNA boyasının ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları 1,2 aracılığıyla hücrelerden dışarı pompalanması ile karakterize edilir. Yöntem başlangıçta murin kemik iliği hematopoetik kök hücrelerini (HSC'ler) izole etmek için kurulmuştur1. Kemik iliği SP hücreleri, CD117 + Sca-1 + Lin-Thy1 düşük ekspresyonu 3,4 ile karakterize edilen bir HSC popülasyonu ile zenginleştirildi. Daha sonra yöntem, kalp kası5, karaciğer6, akciğer7, böbrek8 ve ön beyin9 dahil olmak üzere diğer dokulardan kök hücreleri izole etmek ve zenginleştirmek için yaygın olarak kullanıldı. Özellikle, yöntem son on yılda kanser kök hücrelerini (CSC'ler) izole etmek için uygulanmıştır. CSC'ler, tümör başlatma, kendini yenileme, kemoterapiye direnç ve metastatik potansiyel özelliklerine sahip küçük bir hücre popülasyonunu temsil eder10. CSC'ler ilk olarak hematopoetik malignitelerde11 tanımlanmış ve daha sonra prostat12, over13, mide14, meme15 ve akciğer16 karsinomu gibi çeşitli solid tümörlerde gözlenmiştir. CSC tanımlaması için çeşitli tekniklerin mevcut olmasına rağmen, SP tekniği, çeşitli dokular ve hücre hatları boyunca geniş uygulanabilirliği nedeniyle tercih edilen bir seçenek olmaya devam etmektedir. Ayrıca, floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) kullanarak CSC'leri izole eden değerli bir tekniktir16,17,18. Deneysel bulgular, SP hücrelerinin belirgin tümörjenite sergilediğini ve kök hücre ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterdiğini göstermektedir19,20. Önceki çalışmamız21 ayrıca, multipl miyelomda izole SP hücrelerinin transkriptomik analizinin, kirpi yolu gibi kök hücrelerle ilişkili sinyal yollarının zenginleşmesini ortaya çıkardığını göstermiştir. Bu arada, akut miyeloid lösemi22'nin SP hücrelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genler üzerinde yol zenginleştirme analizleri yaptık. Değiştirilmiş genler, kök hücre ile ilgili yolaklarda (Wnt / β-katenin, TGF-β, Kirpi, Çentik) zenginleştirildi. 1 x 105 SP hücrelerinin BALB / c boş farelerde22 tümör oluşturabildiğini, SP olmayan hücrelerin ise oluşturamadığını bulduk, bu da SP hücrelerinin lösemi kök hücrelerinin özelliklerine sahip olduğunu gösteriyor. CSC'lerin tanımlanmasında Hoechst SP yönteminin etkinliği açıktır.

Hoechst SP protokolü, araştırmanın ilerlemesi yoluyla rafine edilmiş ve geliştirilmiştir. Protokol, boya konsantrasyonunun, hücre yoğunluğunun, inkübasyon sıcaklığının ve süresinin, tampon bileşiminin ve pH değerinin sıkı kontrolünü gerektirir. Bu protokole uygun olarak hazırlanan hücre örnekleri akım sitometrik analize tabi tutuldu. Hoechst boyasının 355 nm'de bir UV lazerle uyarılması ve hem 690/50 nm filtre (Hoechst Red) hem de 450/50 nm filtre (Hoechst Blue) kullanılarak floresan emisyonunun tespit edilmesi nedeniyle, FCM için 350 nm'lik bir lazer gereklidir. Bununla birlikte, 350 nm lazerler, yüksek maliyetleri nedeniyle çoğu FCM'de yaygın olarak donatılmamaktadır. Bu nedenle, SP hücrelerinin akış sitometrisi ile etkili bir şekilde saptanması için boya uyarımı için alternatif bir yaklaşım bulmaya çalıştık. Bu çalışmada, 375 nm ve 405 nm lazerlerin SP hücrelerini tespit etme yeteneği değerlendirildi ve 355 nm lazer ile karşılaştırıldı. Bulgularımız, 355 nm, 375 nm ve 405 nm lazerler tarafından tespit edilen SP hücreleri arasında dikkate değer bir benzerlik olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin, SP hücre tespiti için 355 nm lazere uygun alternatifler olarak hizmet edebileceğini göstermektedir. Hoechst 33342 için ek uyarma ışık kaynaklarının dahil edilmesi, daha fazla akış sitometrisi modelinin kullanılmasını kolaylaştırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmadaki deneylerde, yaşları 8 ila 12 hafta arasında değişen toplam 10 C57BL / 6 fare kullanılmıştır. Deneysel işlemler, Sichuan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#201609309) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Bu makalede kullanılan deneysel materyaller ve akış sitometrisi parametreleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Fare kemik iliği hücrelerinin izolasyonu ve toplanması

  1. Fareleri kurumsal yönergelere sıkı sıkıya bağlı olarak ötenazi yapın. Farede bilinç kaybına neden olmak için,% 2 izofluran ile başlayan inhalasyon anesteziklerini uygulayın, ardından solunumun kesilmesine kadar% 5 izoflurana dozajda kademeli bir artış yapın.
  2. Fareleri cerrahi süitte veya Çeker Ocakta inceleyin. Fareleri% 70 etanol ile temizleyin ve sterilize edin.
  3. Bacağın derisini ve kasını keskin bir makasla tamamen kesin ve uyluk kemiğini inceleyin.
  4. Femuru bir havanda öğütme çubuğuyla nazikçe ezin ve kemik beyazlaşana kadar kemik iliği hücrelerini DMEM ortamı ile yıkayın.
  5. Elde edilen kemik iliği hücrelerini 100 μm'lik bir filtre ile 15 mL'lik tüplere süzün. 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatan ve lizaz kalıntı kırmızı kan hücrelerini 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile 4 ° C'de 1 dakika boyunca atın. 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra tekrar DMEM ortamı ile yıkayın.
  7. Hücreleri 2 mL inkübasyon çözeltisinde (DMEM ortamı +% 5 FBS) yeniden süspanse edin, hücreleri otomatik hücre sayacı ile sayın ve hücre konsantrasyonunu inkübasyon çözeltisi ile 1.0 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.

2. Hücresel lekelenme

  1. Her fareden 2 mL kemik iliği hücresi süspansiyonunu 5 μg / mL Hoechst 33342 ile destekleyin. Başka bir 1 mL alikot'a, negatif kontrol olarak 100 μM verapamil ekleyin.
  2. 37 ° C'de bir su banyosunda 90 dakika boyunca her 30 dakikada bir hafif çalkalama ile inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, hücreleri 5 dakika buz üzerinde soğutun ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri soğuk çalışan bir çözelti içinde (HBSS +% 2 FBS) yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. Elde edilen hücre peletini numune başına 500 μL çalışan çözelti içinde yeniden süspanse edin. FCM analizinden önce, hücreleri 2 μg / mL propidyum iyodür (PI) ile destekleyin ve yaklaşık 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun.

3. Akış sitometrisi

NOT: Kullanılan çeşitli sistemlerin ve konfigürasyonların bir özeti için lütfen Tablo 1'e bakın.

  1. FCM'lerde günlük kalite kontrol (QC) florosferlerini kullanarak gerekli kanalların Varyasyon Katsayısı (CV) değerlerini kalibre edin ve kalite kontrolünün başarıyla tamamlanmasını takiben numune testi yapın.
    1. Yazılımın masaüstü kısayolunu seçin ve yazılımı başlatın.
    2. QC deneyine erişmek için QC/Standardization (Kalite Kontrol/ Standartlaştırma) menüsünde Start QC/Standardization (Kalite Kontrolünü Başlat) öğesini seçin.
    3. QC florosfer numune tüpünü tüp tutucuya yerleştirin.
    4. Örneği yüklemek ve QC prosedürünü çalıştırmaya başlamak için Başlat'ı seçin. FCM'ler, kalite kontrol geçtikten sonra kullanıma hazırdır.
  2. 690/50 nm kanalında Hoechst kırmızısı ve 450/50 nm kanalında Hoechst mavisinin tespiti için aynı numunelerin Hoechst 33342 boyasını sırasıyla 355 nm, 375 nm ve 450 nm lazerle uyarın.
    1. Dosya menüsünde Yeni Deneme'yi seçerek yeni bir deneme oluşturun, dosya yolunu belirtin ve denemeyi kaydedin.
    2. Ayarlar menüsünde Kanal Ayarla'yı seçin. Kanal sinyali onay kutusunu seçin (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), ardından Etiket sütununa reaktif adını ekleyin (Y585: PI; V450: Hoechst Mavisi-405 nm; V660: Hoechst kırmızı-405 nm; NUV450: Hoechst Mavisi-375 nm; NUV660: Hoechst Mavisi-375 nm; UV450: Hoechst Mavisi-355nm; UV660: Hoechst Mavisi-355 nm).
    3. Çizimler oluşturmak için çizim alanındaki Sahte Renk Grafikleri simgelerini tıklatın. Hangi kanalın görüntüleneceğini değiştirmek için bir eksen adı seçin.
    4. Yeni numune tüpleri oluşturmak ve adlarını değiştirmek için Test Tüpü ekranında Tüp Ekle'ye tıklayın.
    5. Örneği yüklemek, grafikleri görüntülemek ve geçitleri oluşturmak için Çalıştır'ı seçin. Kazanç ve eşik ayarlarını yapın. Verileri kaydetmek için Kaydet'i seçin.
  3. Kapı ayar mantığını tasarlayın.
    1. İlk çizim için, FSC-W'yi seçmek için X eksenine tıklayın ve FSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. Tek tek hücreyi daire içine almak ve bitişik hücreleri dışlamak için A kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1A).
    2. İkinci çizim için, FSC-A'yı seçmek için X eksenine tıklayın ve SSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. Parçalı olmayan hücreleri ayırmak ve hücresel kalıntıları dışlamak için B kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1B).
    3. Üçüncü çizim için, PI-A'yı seçmek için X eksenine tıklayın ve SSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. D kapısını çizmek için Çokgen Kapısını seçin. Negatif PI sergileyen Canlı hücreleri seçin (Şekil 1C) ve canlı hücreler elde etmek için C kapısını çizin.
    4. Dördüncü iki boyutlu çizim için, Hoechst Red'i seçmek için X eksenine tıklayın ve Hoechst Blue'yu seçmek için Y eksenine tıklayın. Grafiği sağ tıklayın ve açılır menüden Özellik'i seçin. Doğrusal Biçim f'yiveya hem X ekseni hem de Y eksenini seçin. SP hücrelerini almak için SP kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1D).
  4. Numune uygunluğunu değerlendirmek için, SP hücresi tespiti için 355 nm spesifik bir akış sitometresi23 kullanın.
  5. Hem kontrol hücrelerini (verapamil eklenmiş) hem de deney hücrelerini tespit etmek için 355 nm (lazer gücü: 20 mW) ve 405 nm (lazer gücü: 80 mW) lazerleri aynı anda kullanın.
  6. İki lazere karşılık gelen 690/50 nm ve 450/50 nm kanallarında floresan sinyalleri elde edin. Hoechst 33342 boyasının berrak SP hücreleri ile 355 nm ve 405 nm lazerlerle etkili stimülasyonunu gözlemleyin (Şekil 2B-C).
  7. Aynı numuneler için, hücre tespiti için 375 nm (lazer gücü: 60 mW) ve 405 nm (lazer gücü: 80 mW) lazerleri kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 2'de, kontrol grubu, Hoechst 33342'nin eliminasyonunu önlemek için kök hücrelerde ABC taşıyıcılarını bloke eden verapamil ile tedavi edildi. Böylece, verapamil olmayan gruptaki kök hücreler Hoechst 33342'yi dışarı atar ve SP hücreleri olarak bilinen negatif bir hücre popülasyonu oluşturur. 355 nm lazer, Hoechst 33342 boyasını etkili bir şekilde uyardı ve kemik iliğinin SP hücrelerinin net bir şekilde gözlemlenmesine neden oldu (Şekil 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Her biri 3-4 fare içeren ve toplam 10 fare ile sonuçlanan üç deney yapmak için açıklanan protokolü kullandık. SP hücrelerinin oranı %0.05 ile %0.76 arasında değişmektedir. Fareler arasında bireysel farklılıkların gözlendiğine dikkat etmek önemlidir. Hoechst örneklerini analiz etmek için dört akış sitometresi kullandık. Akış sitometrisinin yeni versiyonunda 20 mW 355 nm'lik bir lazerle Hoechst boyasının uyarılmasının, eski moda akış sitometrisindeki 100 mW 355 nm'lik bir lazere eşdeğe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 81800207) J.H.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Beckman Coulter, Inc.'in akış sitometrisi ve parametre kalibrasyonu için destek sağlamadaki yardımı büyük beğeni topluyor. Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Stomatoloji Hastanesi, Devlet Ağız Hastalıkları Laboratuvarı'ndan Jiao Chen'e ve Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Rejeneratif Tıp Araştırma Merkezi'nden Yu Qi'ye akış sitometrisi veri toplamadaki yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Automatic cell counterCountstar1M1200
Cell Filter(100 µm)BIOFILCSS-013-100
Daily quality control fluorospheresBeckman CoulterB5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)CORNING10-013-CVRC
Fetal bovine serumCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
Red blood cell lysis bufferBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

Referanslar

  1. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  2. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  3. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  4. Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1. Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).
  5. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  6. Terrace, J. D., et al. Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells. Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).
  7. Martin, J., et al. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).
  8. Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity. J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).
  9. Mouthon, M. A., et al. Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'. J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).
  10. Cordon-Cardo, C. Cancer stem cells. Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).
  11. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  12. Yun, E. J., et al. Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).
  13. Lupia, M., Cavallaro, U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity. Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).
  14. Zhao, R., et al. AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).
  15. Liu, S., et al. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).
  16. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  17. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  18. Haraguchi, N., et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).
  19. Zhou, J., et al. Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).
  20. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).
  21. Wang, F., et al. ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population. Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).
  22. Wang, F., et al. Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway. Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).
  23. Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. Analysis of side population in solid tumor cell lines. J Vis Exp. (168), e60658(2021).
  24. Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform. Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de bu aysay 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır