Gelişmiş Doğruluk için Fare Ürodinamik Tekniklerini Optimize Etme

Özet

Bu protokol, kürk ve cilt tarafından idrar emilimini önlemek için cildin siyanoakrilat ile su geçirmez hale getirilmesi için bir kılavuz sağlar. Yapıştırıcının cilde uygulanması, bir mesane kateterinin implante edilmesi ve uyanık farelerde sistometri ve dış üretral sfinkter elektromiyografi kayıtları için elektrotlar için talimatlar içerir.

Özet

Uyanık farelerde idrar parametrelerinin doğru ölçümü, özellikle nörojenik mesane travma sonrası omurilik yaralanması (SCI) gibi durumlarda alt üriner sistem (LUT) disfonksiyonunu anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, farelerde sistometri kayıtlarının yapılması dikkate değer zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Fareler kayıt seansları sırasında yüzüstü ve kısıtlı bir pozisyonda olduğunda, idrar kürk ve deri tarafından emilme eğilimindedir ve bu da işeme hacminin (VV) hafife alınmasına yol açar. Bu çalışmanın amacı, uyanık farelerde sistometri ve eksternal üretral sfinkter elektromiyografi (EUS-EMG) kayıtlarının doğruluğunu arttırmaktı. Üretral meatus ve karın çevresinde su geçirmez bir cilt bariyeri oluşturmak, idrar emilimini önlemek ve hassas ölçümler sağlamak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanan benzersiz bir yöntem geliştirdik. Sonuçlar, siyanoakrilat uygulandıktan sonra, VV ve RV toplamının infüze edilen salin hacmi ile tutarlı kaldığını ve deney sonrası gözlenen ıslak alan olmadığını ve idrar emiliminin başarılı bir şekilde önlendiğini göstermektedir. Ek olarak, yöntem aynı anda dış üretral sfinkter (EUS) ile bağlantılı elektrotları stabilize etti, stabil elektromiyografi (EMG) sinyallerini sağladı ve uyanmış farenin hareketi ve deneycinin manipülasyonundan kaynaklanan artefaktları en aza indirdi. Metodolojik ayrıntılar, sonuçlar ve çıkarımlar tartışılmakta ve klinik öncesi araştırmalarda ürodinamik tekniklerin geliştirilmesinin önemi vurgulanmaktadır.

Giriş

İdrarın depolanması ve serbest bırakılması, idrar kesesinin ve dış üretral sfinkterin (EUS) koordineli aktivitesine bağlıdır. Nörojenik mesane gibi bazı patolojilerde, hem mesane detrusor kasları hem de sfinkter işlevsiz hale gelebilir ve özellikle travmatik omurilik yaralanması (SKY) sonrası önemli mesane sorunlarına yol ^açabilir1.

Küçük kemirgenler, alt üriner sistemin (LUT) klinik öncesi işlevini incelemek için deneysel bir model olarak yaygın olarak ^{kullanılır2}. Dolgu Sistometrisi (FC) ve EUS elektromiyografi (EUS-EMG) kayıt teknikleri, yöntem seçimine, doğru ölçüme ve sonuçların yorumlanmasına bağlı olarak kesin objektif bilgiler sağlayabilir³. Ürodinamik testler, işeme hacmini (VV), işeme verimliliğini (VE) ve mesane kapasitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır⁴. VE, mesanenin kendini ne kadar etkili bir şekilde boşaltabildiğini ölçer. Boşluklu hacmin, boşluklu ve artık hacimlerin toplamına (VV+RV) bölünmesiyle hesaplanır. Öte yandan, mesane kapasitesi, VV'nin (idrar yaparken dışarı atılan idrar miktarı) RV'ye (idrar yaptıktan sonra mesanede kalan idrar miktarı) eklenmesiyle ^hesaplanır5. Bu nedenle, VV ve RV ölçümü, diğer parametrelerin çıkarılmasının anahtarıdır.

Ürodinamik testler sırasında farelerde VV'nin hassas bir şekilde ölçülmesi çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Kemirgenlerin idrarı, yüzüstü pozisyonda fiziksel olarak kısıtlandığında, yerçekiminin^{etkisiyle ventral} karın duvarından aşağı doğru çekilme eğilimindedir 6. Bu fenomen, idrarın karın kürkü ve derisi tarafından emilmesine yol açabilir ve bu da atılan idrar hacmini hafife alır. Fare tarafından üretilen az miktarda idrar göz önüne alındığında, bu absorbansın sonuçların doğruluğu üzerindeki etkisi daha da belirgindir⁷. Ayrıca, SCI modellerinde, detrusor sfinkter dissinerjisinin (DSD) etkisine bağlı olarak VV genellikle normal farelerden daha düşüktür, bu da sızıntı noktası basınçları ve kürk tarafından idrar emilimi riskini artırır⁸. Bu faktörlerin sonuçlar üzerinde önemli bir etkisi vardır. Bu nedenle, farelerde terminal ürodinamik çalışmalar sırasında VV ve RV'nin doğru ölçümü çok önemlidir⁹. Şu anda, fare modellerinde idrar hacminin doğru bir şekilde nasıl ölçüleceği konusunda yayınlanmış literatürde sağlanan metodolojilerde ayrıntı eksikliği vardır.

Siyanoakrilat yapıştırıcı, hızlı ve etkili bağlanma özellikleri nedeniyle insan ve hayvan modellerinde cerrahi prosedürlerde yaygın olarak kullanılan bir yapıştırıcı türüdür 10,11,12. Bu yapıştırıcı, cilde uygulandığında güçlü ve esnek bir bağ oluşturduğu için özellikle yaraları ve yırtıkları kapatmak için kullanışlıdır¹³. Ayrıca, kürk ve yaralarla temas edebilecek idrar ve ıslaklığa karşı büyük bir bariyer olabilir¹¹.

Bu makalede, uyanık farelerde sistometri ve EUS-EMG kayıtlarında kesin sonuçlar elde etmek için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanan yeni ve uygun maliyetli bir teknik geliştirdik. Bu yöntem, mesane disfonksiyonunun altında yatan nedenleri anlamada ve AÜS bozuklukları için daha etkili tedaviler geliştirmede faydalı olacaktır.

Protokol

Hayvan çalışma protokolü, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Onay Kodu: 21098MD/R/MSS/HZ Onay Tarihi: 29 Eylül 2021.

1. Kateterin hazırlanması

1. 30 cm'lik bir polietilen PE-30 tüp (.017 inç x .030 inç) kesin. Tüpün bir ucunu alevlendirmek için bir çakmak kullanın, aleve temas etmediğinden emin olun ve tüp uygun şekilde yuvarlak, çan şeklinde bir uç oluşturduğunda çakmağı geri çekin.
2. 25G iğnenin yaklaşık 3 / 4'ünü tüpün diğer ucuna dikkatlice yerleştirin. 1 mL'lik bir şırınga hazırlayın ve steril% 0.9 NaCl ile doldurun. Şırıngayı 25 G iğneye bağlayın.
3. Uygun bir yuvarlak uç olup olmadığını ve iğnenin uçlarından sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için salini hafifçe demleyin. Basınç hissedilmediğinden ve salinin kateterden düzgün bir şekilde aktığından emin olun.

2. Elektrotların hazırlanması

1. 20 cm uzunluğunda 2 çelik tel hazırlayın. Çelik telleri alın ve telin 5 mm'sini sıyırmak için kaplama bölgesinin her iki ucuna kum cilası uygulayın.
2. 25G'lik bir iğne alın ve telin bir tarafına yerleştirin. Tele zarar vermemek için iğneyi dikkatli bir şekilde soktuğunuzdan emin olun. Telin soyulmuş kısmını bir kanca gibi bükün. Kanca, telin EUS kasına bağlanmasına yardımcı olacaktır.
3. Pimi şeritli telin diğer ucuna takmak için lehim kullanın. Lehimleme, pimi kabloya sabitlemeye ve güçlü bir bağlantı sağlamaya yardımcı olacaktır. Kalay-kurşun lehimlemeyi eriyene ve teli ve pimi kaplayana kadar ısıttığınızdan emin olun.

3. Hayvanın hazırlanması

1. Dişi C57BL/6 fareyi (8 haftalık, 18-20 g vücut ağırlığında) 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü ve suya ve standart gıda peletlerine sınırsız erişim ile Kurumsal Hayvan Bakımı'na göre hayvan tesisinde barındırın.

4. Ameliyat sırasında anestezi

1. Hayvanları %2 izofluran ve saf oksijen (1 L/dk) odasına yerleştirin. Maskeye aktarmadan önce negatif ayak parmağı çimdikleme muayenesi kullanarak hayvanın tam anestezisini onaylayın. Onaylandıktan sonra, gaz durumunu bir maske ile değiştirin.
2. Anestezi maskesinin steril cerrahi alan üzerinde uygun pozisyonda sabitlendiğinden emin olun. Anestezi uygulamaya devam etmek için hayvanı, burnu inhalasyon küçük bir maske (% 2 izofluran ile 0.8-1 L / dak) ile steril örtünün üzerine sırtüstü yerleştirin.

5. Cerrahi hazırlık

1. Hayvanın uzuvlarını bantla sabitleyin. Alt karın bölgesinin kürkünü ve üretral meatus (genital bölge) çevresini tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın.
2. Gözlerde herhangi bir olası kuruluğu önlemek için bir göz merhemi sürün. Povidon-iyot solüsyonu kullanarak traş edilmiş alanı hazırlayın ve solüsyonu %70 etanol ile silin. Ameliyat bölgesine steril bir örtü koyun.

6. Cerrahi prosedür

1. Mesane kateter implantasyonu
   1. Cerrahi mikroskop altında, Metzenbaum düz, künt makas kullanılarak, abdominopelvik cildin orta hattında 1-2 cm'lik bir kesi oluşturulur. Kesi yarasından mesaneyi ortaya çıkarmak için orta hattaki fasya ve kasları kesmeye devam edin.
   2. Mesane insizyonel yaradan göründüğünde, cerrahi alanın net bir görüntüsünü elde etmek için çevredeki organları veya dokuları gerektiği gibi geri çekmeye devam edin. Mesane üzerinde gereksiz manipülasyon veya gerginlikten kaçınmaya dikkat edin, çünkü bu, idrar kaçırma veya çevredeki yapıların yaralanması gibi komplikasyonlara yol açabilir.
   3. Mesane kubbesini kavrayın ve konik uçlu bir iğne ile 5-0 emilmeyen monofilament sütür kullanarak bir çanta ipi yerleştirin.
   4. Mikro makas kullanarak, çanta ipi içinde küçük bir sistostomi oluşturun ve idrar dışarı akana kadar bir delik açın.
   5. Kateterin yuvarlak uçlu ucunu kavrayın ve delikten geçirin. Tüpün ucu delikten geçtikten sonra, çanta ipini tüpün etrafına dikin. Ardından, uç kısmı dikişin altında hissedilene kadar tüpü yavaşça dışarı doğru çekin.
   6. Mesaneyi şişirmek için tüpün diğer ucundan 1 mL salini yavaşça infüze edin. Kateter çevresinde herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntı varsa, ek bir dikiş yerleştirin.
   7. Salin üretradan çıktığında, mesaneyi sıkıştırmak için salini geri çekin.
2. EUS elektrot implantasyonu (Şekil 1)
   1. Karın kesisini pelvik tabana kadar uzatmak için cerrahi makas kullanın.
   2. Mesane ile aynı hizada, kasları ve zarları pudendal kanallara hareket ettirin ve üretra ve dış sfinkter kasını bulun. İliak ve orta kaudal damarlara ve pudendal sinirlere zarar vermemeye dikkat edin.
   3. Elektrot içeren iğneyi kullanarak cildi üretral meatustan 1 cm uzakta iki taraflı olarak delin.
   4. Kanca ucunu forseps ile dikkatlice tutun ve iğneyi yavaşça ciltten çekin.
   5. Elektrotun ucunu kullanarak, EUS kasını iki taraflı olarak dikkatlice asın. Çok derin yumruklamaktan kaçının, çünkü bu kaslara zarar verebilir ve bu da olası idrar sızıntısına neden olabilir.
   6. Pelvik ve karın kaslarını ve cildini dikmek için 3-0 emilmeyen monofilamenti kullanın.
3. Cildin su geçirmez hale getirilmesi
   1. Elektrotları yerine sabitlemek için elektrotların çıktığı cilde ince bir tabaka siyanoakrilat yapıştırıcısı sürün.
   2. Siyanoakrilat yapıştırıcıyı üretral meatusu çevreleyen 1 cm uzağa ve karın ve dikişli bölgeye 3 cm daha uzatarak uygulayın. Yapıştırıcı ile teması önlemek için, meatusu forseps ile dikkatlice tutun.
   3. Yapıştırıcıyı kurutmak için hızlandırıcı sıvısını çekmek için 0,5-10 μL'lik bir mikropipet kullanın.
      DİKKAT: Hızlandırıcı sıvı yanıcı bir sıvıdır.
   4. Uygun yapışma reaksiyonunu sağlamak için hızlandırıcı sıvıyı ekleyin. Bu, yapıştırıcının daha hızlı kurumasına yardımcı olacak ve güvenli bir şekilde oturmasını sağlayacaktır.
4. Ürodinami hazırlık
   1. 4,5 cm uzunluğunda, genişliğinde ve derinliğinde ters polistiren bir tartım teknesi hazırlayın. Farenin üretra etusunu bu boşluğa koymak için 4 cm'lik bir tabana sahip üçgen şeklinde kesin. Tek kullanımlık taban kalıbını, 37 mm x 24 mm x 5 mm, idrarı toplamak için boşluğun altına koyun.
   2. Fareyi yüzüstü pozisyonda yeniden konumlandırın ve dikkatlice gaz maskesi ile donatılmış özel yapım bir plakaya taşıyın.
   3. Üretral meatusun oluk içinde düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Farenin başını ve uzvunu bantla nazikçe tutun ve fare tam bilincini geri kazanana kadar plakayı bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin (Şekil 2).
   4. Sistometriyi yalnızca fare tamamen uyanık olduğunda, yani anesteziden iyileştikten en az 40 dakika sonra gerçekleştirin.

7. Sistometri ve EUS-EMG kayıt hazırlığı

1. İnfüzyon pompasını üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin.
2. 19.05 mm çapında 20 mL'lik bir şırınga alın ve oda sıcaklığında steril% 0.9 NaCl ile doldurun. Şırıngayı infüzyon pompasına sabitleyin. İnfüzyon hızını 0.01 mL / dk'ya ayarlayın.
3. Şırıngayı PE-30 tüpü ile üç konektörün bir tarafına bağlayın. Mesane kateterini diğer tarafa bir basınç dönüştürücüsüne bağlayın. Mesane kateterini bağlamadan önce, tüm hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun.
4. Basınç dönüştürücüyü fare mesanesi ile aynı seviyeye sabitleyin. Basınç dönüştürücü, bir amplifikatör aracılığıyla veri toplama sistemine bağlanır.
5. Bir topraklama hattı kancasını cilde ve diğerini elektrot konektör yerlerine takın. Yazılımdaki basıncı kaydedin.
6. Yazılımı başlattıktan sonra intravezikal basıncı (IVP) ve EUS-EMG sinyallerini kontrol edin. Örnek adını kaydedin ve saati ayarlayın.
7. Pompa infüzyonunu başlatın. Sinyalleri kaydedin.

Sonuçlar

Verilerin analizinde sistometri ve EUS-EMG aktivite izlemeleri kullanıldı. Sürekli sistometri yöntemi, salinin mesaneye infüzyonunu ve aynı anda mesanedeki basınç ve hacim değişikliklerinin ölçülmesini içerir. VV'yi ölçmek için, 0.01 mL / dk hızında 0.4 mL salin infüze edildi ve idrar bir kapakta 40 dakika boyunca toplandı. İşeme sonrası rezidüel (PVR), salinin kateterden aspire edilmesiyle elde edilebilir. Tutkalsız normal farelerde, VV ve RV'nin toplamı genellikle 0.4 mL'den azdı. Deneyden s...

Tartışmalar

Bu ürodinamik teknik, uyanık ve kısıtlanmış farelerde idrar hacmini ve EUS-EMG sinyalini ölçmek için geliştirilmiş bir prosedürü tanımlar. Üretral meatus ve abdominal bölge çevresinde kürk varlığı, idrarı emerek VV ölçümünün doğruluğunu etkileyebilir. Üretral meatus ve karın bölgesini çevreleyen kürk ameliyattan önce dikkatlice traş edilmiş olsa da, bu bölgelerdeki ve derideki kalan küçük tüyler hala idrarı emiyor ve genellikle kayıttan sonra karın bölgesinde ıslak bir alan ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accelerator	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate	TED PELLA, Inc	14478
Disposable base mold	TED PELLA, Inc	27147-4
Infusion pump	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Polyethylene Tubing 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Sterile Weighing Boat	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022