Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

Özet

Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.

Özet

Protokol, sağlam Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde (CNS) 2-foton lazer sistemi ile tek nöron ablasyonunu tanımlar. Bu non-invaziv yöntem kullanılarak, gelişmekte olan sinir sistemi hücreye özgü bir şekilde manipüle edilebilir. Bir ağdaki bireysel nöronların gelişimini bozmak, sinir sisteminin sinaptik girdi kaybını nasıl telafi edebileceğini incelemek için kullanılabilir. Bireysel nöronlar, Drosophila'nın dev lif sisteminde, iki nörona odaklanarak spesifik olarak kesildi: presinaptik dev lif (GF) ve postsinaptik tergotrokanteral motor nöron (TTMn). GF, kaçış tepkisi için çok önemli olan ipsilateral TTMn ile sinaps yapar. 3^{. instar} beyindeki GF'lerden birinin, GF aksonal büyümeye başladıktan hemen sonra kesilmesi, CNS'nin gelişimi sırasında hücreyi kalıcı olarak uzaklaştırır. Kalan GF, eksik komşuya reaksiyona girer ve kontralateral TTMn'ye ektopik bir sinaptik terminal oluşturur. Bu atipik, iki taraflı simetrik terminal, boya eşleşmesi ile gösterildiği gibi her iki TTMN'yi de innerve eder ve elektrofizyolojik deneylerle gösterildiği gibi her iki motor nöronu da çalıştırır. Özetle, tek bir internöronun ablasyonu, bir nöronun kaybını telafi edebilen ve kaçış devresine normal tepkileri geri yükleyebilen iki taraflı bir nöron çifti arasındaki sinaptik rekabeti gösterir.

Giriş

Lazer ablasyon, çok çeşitli organizmalarda nöral devreleri diseksiyon etmek için tercih edilen bir araçtır. Solucanlar ve sinekler gibi model genetik sistemlerde geliştirilen, sinir sisteminin yapısını, işlevini ve gelişimini incelemek için hayvanlar aleminde uygulanmıştır ^1,2,3. Burada, Drosophila'da devre montajı sırasında nöronların nasıl etkileşime girdiğini araştırmak için tek nöron ablasyonu kullanıldı. Sineğin kaçış sistemi, analiz için favori bir devredir, çünkü yetişkin sineğin en büyük nöronlarını ve en büyük sinapslarını içerir ve devre son yıllarda iyi ka....

Protokol

Protokol için kullanılan tüm hayvanlar Drosophila melanogaster türündendi. Bu türün kullanımını çevreleyen herhangi bir etik sorun yoktur. Bu işi yürütmek için etik izin gerekli değildi. Çalışmada kullanılan Drosophila türlerinin, reaktiflerinin ve ekipmanlarının detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Drosophila'nın yetiştirilmesi ve doğru larva aşamasının seçilmesi

1. Kesilecek hücrelerde ifadeyi yönlendiren bir Gal4 sürücü hattı seçin ve bunu bir UAS-GFP raportör hattıyla yeniden birleştirin veya çaprazlayın. 25 ° C'de standart sinek yemi üzerindeki sinekleri yük....

Tartışmalar

2 fotonlu bir mikroskop ile hücre ablasyonunun, Drosophila'da nöronal devre gelişimini manipüle etmek için oldukça başarılı bir yöntem olduğu kanıtlandı. Bu yöntem non-invaziv olduğu için hayvana minimum zarar verir. Veriler, bilinen devrelerin bu hücreye özgü manipülasyonunun kullanışlılığını desteklemektedir.

Ablasyonun başarısı için en uygun Gal4 sürücüsünü seçmek çok önemliydi. GFS iyi çalışıldığından, birçok özel Gal4 sürücü hatt.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185