JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnsan iPSC'den türetilen 3D hepatik organoidler, tiroid hormonunun karaciğer gelişimi üzerindeki etkisini anlamak için potansiyel bir araç oluşturur.

Özet

Kültürde stabil hepatik hücrelerin elde edilmesi, karaciğer çalışmaları için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Bunu akılda tutarak, insan hepatik organoidlerinin (HHO'lar) 3D kültürlerini oluşturmak için insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) kullanan optimize edilmiş bir yöntem tasvir edilmiştir. HHO'ların kullanımı, karaciğer gelişimini anlamak, karaciğer hastalıklarını çözmek, ilaç geliştirme için yüksek verimli çalışmalar yürütmek ve karaciğer nakli potansiyelini keşfetmek için değerli bir yaklaşım sunar. Önceki araştırmada, immünofloresan ve kantitatif RT-PCR teknikleri aracılığıyla, hepatoblastlar ve iki tip hepatoblast türevi hücre gibi çeşitli hücre popülasyonlarının varlığını belirleyerek ilerleme izlendi: kolanjiyositler veya hepatosit benzeri hücreler, farklı gelişim aşamalarında. Bu rapor, insan embriyo gelişiminin aşamalarını yansıtan HHO'ları elde etmek için hiPSC'den başlayarak basit bir 3D protokol sunar. 46-50 günü kapsayan protokol birkaç adımı kapsar: (i) HHO'ları oluşturmak için hiPSC kültürünün titiz yönetimi, (ii) 2D'de hücre farklılaşmasının başlatılması ve ardından 3D'ye geçiş ve (iii) HHO'ları tek hücreli RNA dizilimi için tek hücrelere ayırmak için optimize edilmiş bir ayrışma stratejisi. Bu yaklaşımın geniş uygulamalarının bir örneği olarak, mevcut protokol daha önce gelişmekte olan karaciğer hücrelerinde tiroid hormonu sinyalizasyonunun rolünü çözmek için uygulanmıştı.

Giriş

Karaciğer, glikoz ve keton cisimleri gibi kolayca kullanılabilen enerji substratlarının mevcudiyetini düzenlemenin yanı sıra ksenobiyotik bileşikleri detoksifiye etmek gibi çeşitli metabolik işlevleri yerine getirir. Son yıllarda, büyük ölçüde alkolsüz steatohepatite (NASH) atfedilen ve tedavi edilmezse siroz veya kansere ilerleyebilen karaciğer hastalıklarının prevalansında önemli bir artış olmuştur1. Bu nedenle, etkili tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için karaciğerin ve buna bağlı hastalıkların metabolik fonksiyonlarını anlamak zorunludur 2,3.

Üç boyutlu (3D) kültürlerin ortaya çıkışı, organ gelişiminin işlevselliğini ve karmaşıklığını ele almak için çığır açan ve yenilikçi bir yaklaşımı temsil eden organoid modelin oluşturulmasına yol açmıştır4. Organoidler, ilgili organın5 işlevlerini ve sitomimarisini taklit eden farklılaşmış hücrelerin 3 boyutlu kendi kendini organize eden agregaları olarak tanımlanır.

Geçtiğimiz on yıllar boyunca, çeşitli insan iPSC'den türetilmiş hücrelerin6 veya yalnızca hepatosit benzeri hücrelerin7 kullanımından, büyüme faktörlerinin veya inhibitörlerin çeşitli karmaşık mikro ortamlarının dahil edilmesine ve tek tabaka7 veya 3D8'de progenitör hücrelerin farklılaşmasına kadar uzanan sayısız insan hepatik organoid (HHO) protokolü yaygın bir ilgi kazanmıştır. Bu yaklaşımlar, yüksek verimli ilaç taramasından9 karaciğer hastalıklarının altında yatan mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi edinmeye10 kadar çok sayıda potansiyel hedefe katkıda bulunmaktadır.

Burada, metodolojik olarak uyarlanmış varyasyonlarla birlikte, belirtilen11 kimyasal ipuçlarına dayalı adım adım bir HHO farklılaşması protokolü gerçekleştirilir. Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) uygun şekilde ele alınması ve yetiştirilmesi, hücre dışı matris jel manipülasyonu, hücre pasajı ve HHO'lara farklılaşma tekniklerinin detaylandırılması ile başlar. Süreç, hiPSC'lerin kesin endoderm (DE)12'ye farklılaşmasını uyararak ve ardından posterior foregut (PFG) tek katmanlı hücrelerin gelişimini teşvik etmek için FGF ve BMP'nin in vivo etkilerini taklit ederekbaşlar 13. 3D mimari, PFG hücrelerinin, kolanjiyositlerin ve hepatositlerin2'nin fetal öncü hücresi olan hepatoblastlar haline gelecek olgunlaşmamış bir hepatik faza farklılaştığı 10. günde elde edilir. Son olarak, 3D yapılar RNA dizileme çalışmaları için tek hücrelere ayrıştırılır. Bu protokolün uygulanabilirliğine bir örnek olarak, bu HHO modelinin, hepatositlerin ve kolanjiyositlerin gelişimi üzerine tiroid hormonu etkisi ve tip 2 deiyodinaz (D2) çalışmasına nasıl uygun olduğu gösterilmiştir14.

Protokol

1. hiPSC yönetimi

NOT: hiPSC'ler (CS03iCTR-n3 hücre hattı) ticari olarak satın alınmıştır. Hücre dışı matriks jel kaplamanın ve hiPSC ortamının uygun yönetimi, hiPSC'lerin plakalara takılması ve beslenmesi için anahtardır. Burada, 6 oyuklu bir plaka için gereken hacimler açıklanmıştır. Organoidlere farklılaşmayacak olan 6 oyuklu plakadan kalan hiPSC'ler, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklanabilir.

  1. Hücre dışı matris jel ve hiPSC ortamının dağıtılması
    1. Hücre dışı matris jel şişesini, gece boyunca 4 °C'de buzlu bir kaba koyarak uygun şekilde çözün.
      NOT: Alıntılamadan önce, seyreltme faktörünün hacmini doğrulamak için analiz sertifikasını kontrol edin. Bu, hücre dışı matris jelinin protein konsantrasyonunu temsil eder; Bu nedenle, bir partiden diğerine değişir.
    2. Hücre dışı matris jeli, önceden soğutulmuş ve etiketlenmiş tüpler kullanarak seyreltme faktörüne (4x, 2x ve 1x) göre uygun alikotlara dağıtın. Dört adet 6 oyuklu plakayı kaplamak için 25 mL soğuk DMEM / F12'ye 4x hücre dışı matris jeli seyreltme faktörü ekleyin. Kapakları derhal laboratuvar sızdırmazlık filmi ile kapatın ve -80 °C'de dondurun. Havaya uzun süre maruz kalmaktan ve alikotlarda kabarcık oluşturmaktan kaçının.
    3. 100 mL hiPSC takviye ortamını gece boyunca 4 ° C'de çözdürün. 400 mL hiPSC bazal ortama ekleyin. 50 mL'lik serolojik pipet ile homojenize edildikten sonra, hiPSC ortamını 40 mL'lik tüplere ayırın ve kullanılana kadar -20 °C'de dondurun.
  2. hiPSC kültürü için plaka kaplaması
    1. 6 oyuklu plakaları numaralandırın ve etiketleyin. Kuru buza batırılmış bir hücre dışı matris jel alikotunu yakınınızda bulundurun.
    2. Bir 6 oyuklu plakayı kaplamak için, bir hücre dışı matris jel alikotunu (1x) 6.25 mL soğuk DMEM / F12'ye (2x'i 12.5 mL'ye ve 4x'i 25 mL DMEM/F12'ye) seyreltin.
    3. Hücre dışı matris jel tüpüne küçük bir hacimde DMEM / F12 (~ 500 μL) pipetleyin. Hücre dışı matris jelini soğuk DMEM / F12 ile çözdürmek ve homojenize etmek için yukarı ve aşağı döndürün, kabarcık oluşumunu önleyin ve tamamen karıştırmak için serolojik bir pipet kullanarak soğuk DMEM / F12 içeren tüpün geri kalanına geri koyun.
    4. 6 oyuklu plakayı kaplamak için (tüm plaka için 6 mL) bir kuyucuğa DMEM / F12'ye 1 mL hücre dışı matris jeli gömün. Plakayı tamamen kaplanana kadar sallamadan hareket ettirerek 1 mL'yi yüzeye eşit olarak dağıtın.
    5. Kullanmadan önce 1 saat oda sıcaklığında (RT) bekletin. 6 oyuklu plaka tamamen kullanılmıyorsa, laboratuvar sızdırmazlık filmi ile kapatın ve buzdolabında 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kaplamalı bir plaka buzdolabında 4 °C'de 1 hafta saklanabilir.
  3. HiPSC'nin çözülmesi ve kültürü
    1. Kullanmadan 1 saat önce (oyuk başına 2 mL) 6 oyuklu kaplanmış plaka ile birlikte RT'de orta ve sıcak hiPSC orta ve sıcak hacmini önceden hesaplayın.
      NOT: Soğuk veya donmuş alikotlar durumunda, kullanmadan 15 dakika önce 37 °C'lik bir inkübatöre veya su banyosuna daldırın.
    2. Bir kriyoviyalden sıvı N2'deki 1 mL hiPSC'yi 6 oyuklu bir plakanın (1: 3 oranı) 3 kuyusuna bölün. 6 oyuklu bir plakanın tamamı için 2 kriyovial kullanın. Burada protokol, hiPSC'lerin bir kriyoviyalden çözülmesini ve kültürünü açıklar. İşlemi 2 kriyovial için tekrarlayın.
    3. Yaklaşık 1 mL donmuş hiPSC içeren kriyoviali, kapaktan tutarak ve yüzeysel sudan kaydırarak, şişenin alt kısmı buz çözülene kadar 37 °C'de bir su banyosuna daldırarak yerleştirin.
    4. Çözüldükten sonra, kriyoviyal etanol ile püskürtün ve 1 mL hiPSC'leri pipetleyin. Boş, konik 15 mL'lik bir tüpte yavaşça dağıtın. Tüpü hafifçe sallarken 5 mL ılık hiPSC medium'u damla damla ekleyin.
    5. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan vakuma bağlı bir cam pipet ile aspire ederek süpernatanı hassas bir şekilde ortadan kaldırın ve bir miktar artık ortam bırakın. Peleti 6 mL ortamda dikkatlice yeniden süspanse edin ve ardından 6 oyuklu plakanın 3 oyuğunda kuyucuk başına 2 mL ekleyin.
      NOT: Doğru büyüme için küçük hiPSC agregaları bırakın.
    6. 6 oyuklu plakayı bükün ve hücre dışı matris jelini, uca kuyunun dibine dokunmadan önceden kaplanmış plakadan aspire edin.
    7. Kuyucuk başına hiPSC'ler ile ortamın 2 mL'sini aktarın. HiPSC agregalarını plaka üzerinde eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe ileri, geri ve yan yana sallayın.
    8. 6 oyuklu plakayı 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde bir inkübatöre yerleştirin. Ortamı günlük olarak değiştirin (kuyu başına 2 mL), ilerleyici büyümeyi kontrol edin.
    9. % 80 büyüme izdihamı elde edildiğinde geçiş hiPSC'leri (4-5 gün sonra; bkz. Şekil 1A). Sağlıklı ve proliferatif hiPSC'lerin özellikleri, büyüyen hücre agregasyonlarının merkezinde belirgin sınırlar ve büyük çekirdeklerin sıkı bir şekilde paketlenmesini içerir.
  4. hiPSC'nin geçirilmesi
    1. HiPSC'ler, oyuk başına yaklaşık 1,2 x 106 hücreyi gösteren %80 birleşmeye ulaştığında, yeni bir 6 oyuklu plakaya geçiş yapın. 1:3 oranında bölün (1 kuyudan 3'e) veya oranı (1:4; 1:6) deneyin gereksinimlerine göre ayarlayın.
    2. Geçişten önce, adım 1.2'de açıklandığı gibi uygun sayıda 6 oyuklu plaka için gerekli hücre dışı matris jel gömmesini hazırlayın.
    3. Süpernatanı her kuyucuktan çıkarın ve oyuk başına 2 mL PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin, ardından 1 dakika boyunca kuyucuk başına 1 mL hiPSC ayırma ortamı ekleyin. Ardından 1 mL hiPSC ayırma ortamını çıkarın.
    4. 6 oyuklu plakayı 7 dakika boyunca 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. Kuyucuk başına 1 mL hiPSC ortamı ekleyin. Hücrelerle birlikte 1 mL hiPSC ortamını 15 mL'lik tüpe pipetleyerek ayırın ve toplayın.
    5. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 6 oyuklu bir plakaya yerleştirmek için 1.3.5-1.3.7 adımlarını tekrarlayın. 6 oyuklu plakayı 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde bir inkübatöre yerleştirin. Adım 1.5'e gidin. gerekirse hiPSC'yi dondurmak için.
  5. Dondurucu hiPSC (Opsiyonel)
    NOT: HO'lara terfi etmek için gereken hiPSC'lerin sayısı, uzun süreli depolanabilecek artık kuyulara neden olabilir. Kriyoviyal depolama için geçişin genişletilmesi gerekiyorsa, hiPSC'ler uzun süreler boyunca muhafaza edilebilir.
    1. Gerekli miktarda kriyoprezervasyon ortamını (hücre oyuğu başına 1 mL) 4 °C'de buza çözün. Kriyotüpleri geçiş sayısı, tarih ve hücre hattı ile etiketleyin. Adım 1.4'teki gibi hiPSC ayırma ortamı ile hücreleri ayırın. 15 mL'lik konik bir tüp içinde.
    2. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin, hücre peletini dikkatlice rahatsız etmeyin. HiPSC agregaları bırakarak peleti 1 mL soğuk kriyoprezervasyon ortamında (kuyu başına) ihtiyatlı bir şekilde yeniden süspanse edin.
      NOT: Kuyular düşük yoğunlukta, %50'den az birleşikse, her 2 kuyucuk için 1 mL kriyoprezervasyon ortamı kullanılabilir.
    3. hiPSC'lerle 1 mL kriyoprezervasyon ortamını kriyotüpe aktarın. Hücre içeriğini homojenize etmek için kriyotüpü hafifçe çalkalayın.
      NOT: Kriyoprezervasyon için daha fazla tüp hazırlıyorsanız, önceden hazırlanmış tüpleri buzda bırakın.
    4. Tüpleri gece boyunca -80 °C'de kontrollü oranlı dondurma kabına yerleştirin. Tüpleri 24 saat sonra sıvı nitrojen tankına aktarın.

2. HiPSC'den hepatik organoidlere adım adım farklılaşma

NOT: Reaktiflerin sulandırılması, üreticinin yönergelerine göre gerçekleştirildi ve takip edildi.

  1. hiPSC'den DE'ye 2D farklılaşması (gün 0-gün 4 (D-0'dan D-4'e); Şekil 1B)
    1. 3 geçişten sonra, hücreler sağlıklıysa ve iyi ve hızlı büyüyorsa, hiPSC'nin farklılaşmasına devam edin. Adım 1.2'de açıklandığı gibi 6 oyuklu bir plakayı kaplayın. hiPSC'yi DE'ye ayırt etmek için, üreticinin talimatlarını izleyerek DE kitini kullanın.
    2. Farklılaşmaya başlamadan önce, DE talimatlarında belirtilen kuyucuktaki hücre konsantrasyonunu elde etmek için 24 saat boyunca 2:1'lik bir geçiş oranında (farklılaşmayı başlatmak için 6 kuyudan 3 elde etmek için) kültür hiPSC'leri.
    3. Aşağıdaki değişikliklerle üreticinin protokolüne göre farklılaşma gerçekleştirin.
      1. hiPSC'ye eklenen Y-27632 konsantrasyonunu 10 μM'den 50 μM'ye yükseltin (Farklılaşmaya başlamadan bir gün önce).
      2. Ayrışma reaktifinin oyuğu başına 1.5 mL'yi ve ayrıca DMEM / F12 hacmini, ayrışma reaktifi ile aynı miktarda arttırın. Her oyuğa 1 mL DMEM / F12 (1.5 üzerinden) ekleyin ve 15 veya 50 mL'lik bir tüpte fazladan 0.5 mL birikin.
  2. DE hücrelerinin PFG hücrelerine farklılaşması (D-4 ila D-10; Şekil 1C)
    1. PFG'ye indüksiyondan günler önce DE hücrelerinin farklılaşması için PFG besiyeri (bazal ortam olarak Gelişmiş DMEM/F12, 1x Glutamax takviyesi, 1x B27 takviyesi, 20 ng/mL BMP4, 10 ng/mL FGF2) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: B27, bileşiminin bir parçası olarak T3 içerir. Tiroid hormonu (TH) çalışmaları söz konusu olduğunda, bundan sonra B27, TH içermeyen ev yapımı B2615 ile değiştirilmelidir.
    2. PFG ortamını (kuyu başına 2 mL) ve gelişmiş DMEM / F12'yi 37 ° C'de 15 dakika veya RT'yi 1 saat ısıtın. Plakanın üzerine eğilin ve hücreleri çizmeden bir vakuma bağlı bir cam pipetle (veya manuel olarak bir P1000 pipeti ile) DE ortamını kuyulardan aspire edin.
    3. Kuyucuk başına 2 mL ılık gelişmiş DMEM / F12 ekleyin ve ardından aspire edin. 6 oyuklu plakaya oyuk başına 2 mL ılık PFG ortamı ekleyin. Önümüzdeki 6 gün boyunca ortamı günlük olarak değiştirin.
  3. 2D PFG hücrelerinden 3D Olgunlaşmamış Hepatik Organoidlere (IHO'lar; D-10 ila D-18)
    NOT: 96 oyuklu ULA plakasının her bir oyuğuna eklenen 30 μL'de yaklaşık 30.000-35.000 hücre gereklidir. Geçiş oranı, farklılaşmış PFG hücrelerinin tek tabakasına sahip 2 kuyudan (6 oyuklu plaka) 2: 1'dir; tam 96 oyuklu ultra düşük bağlantı (ULA) plakası sağlayacaktır (Şekil 1D).
    1. 3D organoidleri başlatmadan önce veya daha önceki günlerde, önceden IHO ortamını hazırlayın (Bazal ortam olarak Gelişmiş DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Deksametazon, 5 μM CHIR99021, 500 nM valproik asit, 50 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng / mL insan hepatosit büyüme faktörü (HGF), 40 ng / mL Pürüzlü-1, 300 ng/mL N-6,20-O-dibutiriladenozin 30,50-siklik 35 monofosfat sodyum tuzu (dbCAMP), 10 μM Nikotinamid) ve 4 °C'de saklayın.
    2. 96 oyuklu ultra düşük ek (ULA) plakasını etiketleyin. PFG hücrelerini ayırmak için, üreticinin talimatlarına göre hücre ayrışma enzimini kullanın.
    3. Kullanmadan önce ayrışma enzimini, gelişmiş DMEM / F12'yi ve PBS'yi 37 ° C'de ısıtın. Kuyucukların PFG ortamını aspire edin ve atın. Kuyucuk başına 2 mL PBS ekleyin, ardından aspire edin.
    4. Hücreleri kuyudan ayırmak için 37 ° C'de 7 dakika boyunca oyuk başına 1.5 mL hücre ayrışma enzimi ekleyin. Hücre ayrışma enzimini çıkarmadan, 1 mL ileri DMEM ekleyin. Tüm hücreleri toplayın ve 50 mL'lik bir tüpe ekleyin.
    5. Bir hücre sayacı veya bir hemositometre ile mL başına hücre sayısını sayın. 150 x g'da 8 dakika santrifüjleyin.
    6. Pelete, gereken son hücre sayısına (30.000-35.000 hücre) ayarlamak için uygun hacmi (96 oyuklu bir ULA plakasının tamamı için 3 mL IHO ortamı) ve 1x hücre dışı matris jeli ekleyin.
    7. 96 oyuklu plakayı 37 °C, %5CO2 ve %95 neme kadar ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. 24 saat (D-11) sonra, hücreler dairesel bir şekilde yeniden toplanacaktır; IHO ortamının oyuğu başına 50 μL ekleyin.
    8. Ertesi gün (D-12), kuyu başına 100 μL IHO ortamına yükseltin. D14'te, her bir kuyucuktan ~100-120 μL'yi ya vakuma bağlı cam pipetle ya da bir pipetle tek tek çıkarın. Organoidleri aspire etmemeye dikkat edin. D-14 ve D-16'da 100 μL IHO ortamı ekleyin.
      NOT: D-16'dan sonra, harekete geçirilmediği için, D18'den sonra kaybolan aşırı büyüme ortaya çıkar.
  4. Hepatoblast organoidleri (HBO'lar, D-18 ila D-26)
    NOT: Bu adımda, 96 kuyulu ULA plakasından gelen IHO'lar 6 kuyulu bir ULA plakasına taşınacaktır. Önceki aşamadaki 96 IHO için, olgunlaşmaya devam etmek için toplam 1 ve 1/2 6 oyuklu ULA plakasını temsil eden kuyucuk başına 10 organoid yerleştirildi (Şekil 1E).
    1. Farklılaşmanın önceki adımlarında yapıldığı gibi, önceki günlerde HBO'ların farklılaşma ortamını hazırlayın.
      1. HBO'lara farklılaşmak için kullanılan reaktif kokteyli adım 2.3'te açıklanmıştır. Valproik asidi çıkarın ve kokteyle aşağıdaki biyokimyasalları ekleyin: BMP7, BMP4 ve FGF7. Nihai bileşim, bazal ortam olarak Gelişmiş DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Deksametazon, 5 μM CHIR99021, 500 nM valproik asit, 50 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng / mL insan hepatosit büyüme faktörü (HGF), 40 ng / mL Pürüzlü-1, 300 ng / mL N-6,20-O-dibutiriladenozin 30,50-siklik 35 monofosfat sodyum tuzu (dbCAMP), 10 μM Nikotinamid, 25 ng/mL FGF7, 50 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7.
    2. Daha önce HBO ortamını (kuyu başına 3 mL) ve Gelişmiş DMEM/F12'yi (kuyu başına 3 mL) 37 °C'de ısıtın. Her kuyucuğa 3 mL ılık gelişmiş DMEM / F12 ekleyin.
    3. 200 mL genişliğinde bir delik ucu ile 96 oyuklu plakadan oyuk başına 10 IHO organoidi dağıtın. Plakanın üzerine eğilerek ve vakuma bağlı cam pipetle (veya bir P1000 ile manuel olarak) emerek gelişmiş DMEM/F12'yi çıkarın.
    4. Kuyucuk başına 3 mL ılık HBO ortamı ekleyin. 6 kuyulu ULA plakalarını açın ve 37 °C, %5 CO2 ve %95 nemde ayarlanmış inkübatörün içinde 65 rpm'de çok platformlu bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 4 gün (D-22) ve 6 gün (D-24) sonra, HBO ortamını (kuyu başına 3 mL) değiştirin.
  5. 2 farklı faz (D-26 ila D-46) yoluyla hepatik organoidlere (HO) olgunlaşma
    NOT: Bu, ortamdaki içerik ve reaktiflerin türüne bağlı olarak iki farklılaşma döneminde meydana gelen son olgunlaşma sürecidir.
    1. HO (HO1) ortamının ilkini önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Jagged1'i çıkarın ve HBO ortamına kıyasla CHIR99021 konsantrasyonunu azaltın. Son bileşim: Bazal ortam olarak gelişmiş DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Deksametazon, 2 μM CHIR99021, 50 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng / mL insan hepatosit büyüme faktörü (HGF), 300 ng / mL N-6,20-O-dibutiriladenozin 30,50-siklik 35 monofosfat sodyum tuzu (dbCAMP), 10 μM Nikotinamid, 25 ng/mL FGF7, 20 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7.
    2. Kullanmadan önce Gelişmiş DMEM/F12 ve HO1 ortamını 37 °C'de ısıtın. Aynı 6 oyuklu ULA plakasında, plakanın üzerine eğilerek ve bir vakuma bağlı cam pipetin ucunu duvara (veya manuel olarak bir P1000 pipeti ile) yerleştirerek önceki HBO ortamını dikkatlice aspire edin.
    3. Kuyucuk başına 3 mL ılık Gelişmiş DMEM / F12 ekleyin ve aspire edin. Kuyucuk başına 3 mL ılık HO1 ortamı ekleyin. Numune toplama ile birlikte HO1 ortamını her 3 günde bir (D-29, D-32, D-35, D-38) değiştirin.
    4. D 38'de, CHIR99021, BMP4, dbcAMP ve FGF7'yi çıkararak ve bunları FGF19 ve DAPT ile değiştirerek ikinci HO (HO2) periyodu için reaktif kokteylini değiştirin. Son besiyeri bileşimi, bazal ortam olarak Gelişmiş DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Deksametazon, 50 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng / mL insan hepatosit büyüme faktörü (HGF), 10 μM Nikotinamid, 20 ng / mL BMP7, 25 ng / mL FGF19, 5 μM DAPT.
    5. Kullanmadan önce Gelişmiş DMEM/F12 ve HO2 ortamını 37 °C'de ısıtın. 6 oyuklu ULA plakasıyla devam edin ve önceki HO1 ortamını dikkatlice aspire edin. Kuyucuk başına 3 mL Gelişmiş DMEM / F12 ekleyin ve çıkarın.
    6. Kuyucuk başına 3 mL ılık HO2 ortamı ekleyin. HO2 ortamını her 4 günde bir değiştirin (D-42, D-46, D-50, ...) ve ortam değiştirilirken aynı günlerde numune alın.

3. Tek hücreli ayrışma

NOT: Bu adım, tek hücreli RNA dizileme tekniği için kritik öneme sahiptir. Organoidlerin sayısı boyuta göre değişebilir ve ayrışma günü ne kadar eski olursa, organoidlerdeki hücre miktarı o kadar büyük olur. Daha önceki günlerde, ayrışmış organoidlerin sayısı arttı ve ayrışma süreleri eşit miktarlarda azaldı. D-14 ve D-17'de 10 organoid, D-23 ve D-26'da 8 organoid, D-30 ve D-45'te 6 organoid ile dissosiyasyon yapıldı. Bir organoid kümesi için prosedürler detaylandırılmıştır (Şekil 1F).

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. % 7.5 Sığır Albümin Fraksiyonu V (BSA) nihai konsantrasyonu ile Advanced-DMEM'i hazırlayın ve homojenize ettikten sonra süzün.
    2. Bazal ortam olarak 1 mL tripsin% 0.5 - EDTA (10x), 50 μM Y-27632, 40 U / μL RNaz inhibitörü ve 1 U / μL DNaz I ile 1 mL ayrışma enzimi ortamı hazırlayın.
    3. Tripsin inaktivasyon ortamını bazal ortam olarak 2 mL Gelişmiş DMEM / F12 +% 7.5 BSA, 50 μM Y-27632, 40 U / μL RNaz inhibitörü ve 1 U / μL DNaz I ile hazırlayın.
    4. Başlamadan önce hem ortamı hem de PBS'yi 37 °C'de ısıtın.
  2. HHO'ların ayrışması
    1. İşyerini ve aletleri RNase temizleyici ile temizleyin. Geniş açık uçlu 15 mL'lik bir polipropilen tüpte farklılaşma gününe göre organoid sayısını toplayın.
    2. PBS 2x-3x ile yıkayınız. Toplanan organoidlerle birlikte 15 mL'lik tüpe 1 mL ayrışma enzimi ortamı ekleyin ve 30 rpm'de 5 dakika boyunca 37 ° C'de tutun.
      DİKKAT: Tüpü külbütörden düşürmemeye dikkat edin.
    3. 5 dakika sonra, önce kapakta kalan organoidleri kontrol edin, ardından organoid başına 10 kez yukarı ve aşağı döndürerek (toplamda 60 kez) organoidleri bir P1000 ile mekanik olarak bozun. Aynı kesintiyi bir P200 ile tekrarlayın. Organoidlerin üzerine sıkışması ihtimaline karşı tüp kapağını kontrol edin.
    4. 15 mL'lik tüpü tekrar külbütöre 5 dakika daha inkübatöre yerleştirin. Bir P4'ü yukarı ve aşağı döndürerek başlayarak ve bir P200 ucuna bağlı 1 mL'lik bir serolojik pipetle devam ederek 10. noktadaki işlemi tekrarlayın.
    5. 15 mL'lik tüpü tekrar külbütöre son 5 dakika boyunca külbütöre yerleştirin. Ayrışma olmaması durumunda, 5 dakika daha bırakın ve manuel bozulmayı tekrarlayın.
    6. 1 mL tripsin inaktivasyon ortamı ekleyin ve homojenize edin. Üstüne 40 μm hücre süzgeci olan yeni bir 15 mL polipropilen tüp yerleştirin. 2 mL'yi (ayrışma enzimi ortamı ve tripsin inaktivasyon ortamı olan hücreler) 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 15 mL'lik tüpe süzün.
    7. 40 μm hücre süzgecinden kalan hücreleri geri kazanmak için 1 mL başka bir tripsin inaktivasyon ortamı ekleyin.
    8. Fiksasyonlarına devam etmek için ayrışmış hücrelerin sayısını saymak için 5 μL'lik bir boya çözeltisi ile karıştırılmış 5 μL tek hücreli ortam alın. Santrifüjleme ve fiksasyon kitinin ilk reaktifi ile yeniden süspansiyondan sonra hücreleri sayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre filtrasyonu gerçekleştirin.

Sonuçlar

HiPSC'den HHO'lara aşamalı olarak farklılaşma protokolünün her aşaması, qPCR ile kantitatif ölçümler ve bibliyografyadan evreye özgü bilinen belirteçlerin immünofloresanı kullanılarak tanımlandı (Şekil 2). Her iki tekniğin adım adım ilerlemesi ve HO'lara doğru farklılaşma ile ilgili elde edilen sonuçlar14'te tasvir edilmiştir. Önceki araştırmada, hiPSC'ler, zamanla azalan iki iyi bilinen Yamanaka faktör...

Tartışmalar

Mevcut protokol, hiPSC'lerin ve sonraki 3D organoid kültürlerin nasıl ele alınacağına dair çeşitli metodolojik ayrıntılar sunmaktadır. Bu, iki ana kritik adımı içerir: (i) 2D kültürlerin ayrılması ve daha sonra 10 gün sonra 3D hepatik organoidlere dönüşmesi ve (ii) bir 3D yapının tek hücrelere hassas bir şekilde ayrılması. Mevcut bilgilere dayanarak, bu, tiroid hormon etkisini incelemek için bir 3D HHO modelinin ilk raporudur ve orijinal olarak P1 karaciğer ...

Açıklamalar

Antonio C. Bianco, Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics için danışmandır. Diğer yazarların konuyla ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK-DK58538, DK65066, DK77148; ACB) olarak adlandırılır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6462All procedures
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6470All procedures
15 mL Polypropilene Conical TubeFalcon (Corning)352097Dissociation Hepatic Organoids
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6465All procedures
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigmaT2877-100Hepatic Organoid differentiation
40 μm Cell Strainer Corning431750Dissociation Hepatic Organoids
50 mL tube Falcon (Corning)352070All procedures
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo fisher scientific140675hiPSC maintenance
A83-01 R&D Systems2939/10Hepatic Organoid differentiation
Advanced DMEM/F12Gibco12634010Hepatic Organoid differentiation
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsART2069GPKAll procedures
B27 supplement Gibco17504044Hepatic Organoid differentiation
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Gibco15260037Dissociation Hepatic Organoids
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue CultureGoldBioA-421-100Dissociation Hepatic Organoids
CHIR99021R&D Systems4423/10Hepatic Organoid differentiation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Hepatic Organoid differentiation
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Hepatic Organoid differentiation
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell lineCedar-sinaihiPSC maintenance
DAPTR&D Systems2634/10Hepatic Organoid differentiation
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGHepatic Organoid differentiation
DexamethasoneR&D Systems1126/100Hepatic Organoid differentiation
DMEM/F12Gibco11320033hiPSC maintenance
DNAse I, RNase-free, HCThermo Fisher scientificEN0523Dissociation Hepatic Organoids
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357551All procedures
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357543All procedures
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, SterileCorning357550All procedures
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Hepatic Organoid differentiation
Glutamax supplementGibco35050061Hepatic Organoid differentiation
L-ThyroxineSigmaT1775-1GHepatic Organoid differentiation
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mLCorning354277Extracellular matrix gel
mFreSRStemcell Technologies5855hiPSC cryopreservation medium
mTeSR 5x Supplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
Multi Platform Shaker Fisherbrand (Thermo Fisher technologies)88861021Hepatic Organoid differentiation
N2 supplement Gibco17502048Hepatic Organoid differentiation
Nicotinamide R&D Systems4106/50Hepatic Organoid differentiation
PBS, pH 7.4Gibco10010023hiPSC maintenance
Recombinant human BMP4  R&D Systems314-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG-200Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF19R&D Systems959-FG-025/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human HGFR&D Systems294-HG-005/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera R&D Systems1277-JG-050Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CFHepatic Organoid differentiation
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC detaching medium
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μLInvitrogenAM2682Dissociation Hepatic Organoids
RNase ZapInvitrogenAM9780Dissociation Hepatic Organoids
Sorvall  Legend XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004539All procedures
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemcell Technologies5110Hepatic Organoid differentiation
Trypan Blue solution (0.4%) Gibco15250061Dye solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604013Cell Dissociation enzyme
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) Gibco15400054Dissociation Hepatic Organoids
Valproic acid, sodium saltR&D Systems2815/100Hepatic Organoid differentiation
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher scientificM79735QDissociation Hepatic Organoids
Y-27632 dihydrochlorideR&D Systems1254Hepatic Organoid differentiation

Referanslar

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780 (2023).
  15. . B27 Supplement Available from: https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016)
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644 (2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242 (2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208 (2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131 (2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

IPSCHepatik Organoidlernsan Hepatik OrganoidleriKaraci er al malarHiPSC lerKaraci er Geli imila Geli tirmemm nofloresanKantitatif RT PCRHepatoblastlarKolanjiyositlerKaraci er NakliH cre Farkl la mas3D K lt r ProtokolTek H creli RNA Dizileme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır