Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon

Özet

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Özet

Mitokondriyal izolasyon, metabolik bozuklukları ve hastalıkları incelemek için moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki öncüler tarafından oluşturulan prosedürleri takiben onlarca yıldır uygulanmaktadır. Mitokondriyal fizyolojiyi ve biyoenerjetik bilimi doğru bir şekilde araştırmak için tutarlı mitokondriyal kalite gereklidir; Bununla birlikte, araştırmacılar için yayınlanmış birçok farklı izolasyon yöntemi mevcuttur. Farklı deneysel stratejiler farklı izolasyon yöntemleri gerektirse de, temel prensipler ve prosedürler benzerdir. Bu protokol, küçük hayvanlar ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli doku kaynaklarından iyi bağlanmış mitokondriyi çıkarabilen bir yöntemi detaylandırır. Özetlenen adımlar arasında organ diseksiyonu, mitokondriyal saflaştırma, protein miktar tayini ve çeşitli kalite kontrol kontrolleri yer alır. Yüksek kaliteli mitokondriyi tanımlamak için kullanılan birincil kalite kontrol metriği, solunum kontrol oranıdır (RCR). RCR, oksidatif fosforilasyon sırasındaki solunum hızının ADP yokluğundaki hıza oranıdır. Alternatif metrikler tartışılmaktadır. Bu protokol kullanılarak doku kaynaklarına göre yüksek RCR değerleri elde edilirken, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde birkaç adım optimize edilebilir. Bu prosedür sağlamdır ve sürekli olarak hayvan modelleri ve doku kaynakları arasında ortalamanın üzerinde RCR değerlerine sahip izole mitokondri ile sonuçlanmıştır.

Giriş

Mitokondri, belirli hücre fonksiyonları için optimize edilmiş sitoplazmik enerjik koşullar oluşturan hücre altı organellerdir. Hücresel, doku ve organizma düzeyindeki çalışmalar mitokondriyal fonksiyon hakkında bilgi sağlayabilirken, organelleri izole etmek, başka türlü mümkün olmayan bir deneysel kontrol düzeyi sunar. Mitokondriyal izolasyonlar 1940'lardan beri gerçekleştirilmekte ve çeşitli hücre ve dokularda metabolizma ve solunumun mekanik çalışmalarına izin vermektedir ^1,2. Mitokondrinin tarihsel önemi de iyi belgelenmiştir³. ATP'nin ana üreticiler....

Protokol

Tüm omurgalı hayvanların kullanımı ve tedavisi, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve kabul edilen onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Bu protokol hem erkek hem de dişi Hartley albino kobayları ve Sprague Dawley (SD) sıçanları kullanılarak tasarlanmıştır. Kobaylardan kardiyak mitokondri izolasyonu için hayvanlar 4-6 haftalık (300-450 g) yaşlarda sakrifiye edildi. Her iki cinsiyetten SD sıçanlardan kardiyak mitokondri 10-13 haftalık (250-400 g) yaşlar arasında elde edildi. Tamponlar için tarifler Tablo 1'de açıklanmıştır....

Tartışmalar

Bu protokolde kısaca tarif edilen yöntemlere bağlı kalmak, diğer doku tiplerine ve kaynaklarına ek olarak, küçük kemirgenlerin kalp dokusundan iyi bağlanmış mitokondrinin izolasyonunu sağlayacaktır. Genel olarak, işlem toplam 3-3,5 saat sürmelidir, bu süre zarfında tüm hayvan dokusu, numuneleri ve izolatları, bozulmayı sınırlamak için mümkün olduğunca 4 °C'de buz üzerinde kalmalıdır. Bu prosedür sağlamdır ve kullanılan deneysel hedeflere ve modellere da.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C