3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Özet

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

Özet

Küresel kültür, geleneksel iki boyutlu (2B) kültürlere kıyasla in vivo mikro ortamın gelişmiş bir replikasyonunu sağlayan bir 3B modeldir. İnvazyon, kanser biyolojisinde son derece ilgi çekici bir hücresel sonuçtur. Bu protokolde, oral skuamöz hücreli karsinom (OSCC), kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF) ve monositlerden oluşan heterosferoidleri kullanarak in vitro kanser hücresi invazyonunu değerlendirmek için alternatif bir strateji geliştirdik. Bu heterosferoidler, kanser hücrelerinin yanı sıra iki ilgili neoplastik olmayan hücre tipi de dahil olmak üzere tümör mikroçevresini (TME) taklit etmeyi amaçlar. Her hücre tipi, sferoid oluşumundan önce farklı dalga boylarında yayılan hayati floresan belirteçlerle etiketlendi. Bir kez oluşturulduktan sonra, heterosferoidler, mikro gözenekli bir zarın üst bölmesinde insan leiomyomundan türetilmiş hücre dışı matrisin bir tabakasına ekildi. İnvazyon, konfokal mikroskopi kullanılarak z ekseninde değerlendirildi. Z ekseninde 90 μm'lik bir derinliği kapsayacak şekilde 10 μm aralıklarla karşılık gelen floresan kanallarında dijital görüntüler elde edildi. Analiz, her görüntüdeki ve floresan kanalındaki entegre floresan yoğunluğu hesaplanarak ücretsiz görüntü yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, çok katmanlı bir bağlamda hücre istila modellerinin daha dinamik bir analizinin yanı sıra, istila sırasında farklı hücre tiplerinin mekansal birlikte lokalizasyonunun incelenmesini sağlar.

Giriş

İstila, neoplastik hücrelerin hücre dışı matriks yoluyla çevredeki dokuya ^1,2 göç ettiği bir süreçtir. Tümör ilerledikçe, neoplastik hücreler giderek daha karmaşık mikro ortamlara maruz kalır. Tümör mikroçevresi, hücre dışı matriksin çeşitli bileşenlerini ve neoplastik olmayan hücre tiplerini içerir. Fibroblastlar ve yerleşik makrofajlar dahil olmak üzere stromal hücreler, hücre dışı matriks bileşenlerini ve büyüme faktörlerini ve sitokinleri salgılayarak mikro çevreyi yeniden şekillendirir ve bu da neoplastik hücre fonksiyonlarını etkiler³. Stromal ve sızan lökosit hücreleri ayrıca neo....

Protokol

Birincil insan hücrelerinin kullanımı, Araraquara Diş Hekimliği Fakültesi - UNESP'nin Kurumsal İnsan Araştırmaları Etik Komitesi (CAAE 57895822.0.0000.5416) tarafından onaylanmıştır. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. 3D hücre kültürü için hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirilmelidir.

1. Heterosferoidi oluşturacak hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını elde edin.
   NOT: Bu deneyde, OSCC hücre hattı (SCC9), fibroblastlar (dil kanseri biyopsilerind....

Tartışmalar

Üç boyutlu sferoid kültürleri, hücre biyolojisinin çeşitli yönlerini araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu çalışmada, tümör mikroçevresini taklit eden heterosferoidler kullanılarak neoplastik hücre invazyonunun değerlendirilmesi için çok katmanlı ve daha dinamik bir yaklaşım sunan bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem, neoplastik olmayan stromal hücrelerin varlığında ko-lokalizasyon ve invazyon paternlerinin değerlendirilmesine izin verir.

Dikkate alınm.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software