Farelerde Kafaya Sabit Sanal Gerçeklik için Davranışsal Eğitim Prosedürleri

Özet

Makale, farelerde yaygın olarak kullanılan doğrusal iz sanal gerçeklik (VR) paradigması için deneysel prosedürlerin yanı sıra, Y şeklinde bir sinyal ayırt etme görevini test ederek karmaşık VR görevlerini çalıştırmanın fizibilitesini belirlemektedir.

Özet

Kafa sabitleme ile birleştirilen sanal gerçeklik (VR), başa sabitlenmiş farelerde karmaşık davranışsal tahlillerin yapılmasına izin verdiği için davranışsal sinirbilim çalışmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu, nöral kayıtlar sırasında hareketle ilgili sinyal gürültüsünü en aza indirmek için kafa fiksasyonu gerektiren çeşitli nörofizyolojik teknikleri birleştirirken hassas davranışsal kayıtlara olanak tanır. Bununla birlikte, VR'nin artan kullanımına rağmen, bunun nasıl uygulanacağına dair ayrıntılı metodoloji hakkında çok az yayınlanmış veri bulunmaktadır. Bu çalışmada, erkek ve dişi C57B16/J farelerin, birden fazla eğitim seansı boyunca uzunluğu 1-3 m'den artırılan sanal bir doğrusal koridorda koşmak üzere eğitildiği bir eğitim protokolü geliştirilmiştir. Bu temel üzerine inşa edilen bu çalışma, bir Y-labirent paradigması kullanarak VR içinde karmaşık davranışlar sergileyen farelerin fizibilitesini araştırdı. Görev, Y-labirentindeki seçim noktasından siyah duvarlı kola gitmeyi gerektiriyordu. % 70'e eşit veya daha fazla doğru olan iki ardışık gün kriterine ulaştıktan sonra, fareler giderek daha zor duyusal ayrımcılığa ilerledi. Bulgular, farelerin VR'de başarılı bir şekilde eğitilmesi için yararlı metodolojiler hakkında önemli ayrıntılar sağlıyor ve farelerin Y-labirentinde gezinmede öğrenme yetenekleri sergilediğini gösteriyor. Sunulan metodoloji, yalnızca VR tabanlı tahlillerde eğitim süresine ilişkin içgörüler sunmakla kalmıyor, aynı zamanda farelerde karmaşık davranışları araştırma potansiyelinin altını çizerek daha kapsamlı sinirbilim araştırmaları için yollar açıyor.

Giriş

Sanal gerçeklik görevleri, serbest davranan farelerde tehlikeye atılacak mekanik stabiliteye izin veren kafa fiksasyonu nedeniyle farelerde güçlü bir davranışsal değerlendirme yöntemi olarak ortaya çıkmıştır¹. Bu yöntem, elektrofizyolojik kayıtlarda ^2,3 ve optik görüntülemede 4,5,6,7 hareket artefaktlarının azaltılmasını sağlar. Ayrıca tekrarlanabilir davranışları⁸ ve hassas göz takibini⁹ kolaylaştırır. Deney düzeneğinde, fare yerine sabitlenir ve hava destekli küresel bir koşu bandının üzerine yerleştirilir. Bu cihaz, VR ortamında görsel olarak yönlendirilen davranışların karmaşık bir şekilde araştırılmasına olanak tanır. Fare koşu bandı üzerinde hareket ettikçe, hareketi, fareyi çevreleyen ekranda görsel olarak gösterilen sanal manzara içindeki navigasyonu ile sorunsuz bir şekilde senkronize olur.

Bu çalışmanın amacı iki yönlüdür: deneysel davranışsal sinirbilimdeki temel zorlukları ele almak ve bu alandaki metodolojilerin ilerlemesine katkıda bulunmak. İlk olarak, akademik araştırmalarda^{VR'nin artan kullanımına rağmen 10,11,12}, bu teknolojinin yeni araştırmacılar tarafından benimsenmesini engelleyen kapsamlı metodolojiler ve eğitim protokollerinin kayda değer bir eksikliği devam etmektedir. Birincil amaç, önceki çalışmalarda^{gösterildiği} gibi, doğrusal yol paradigması için ayrıntılı bir eğitim rejimi tanımlayarak bu boşluğu doldurmaktı 13,14,15. Bu operasyonel prosedürleri tanımlamak için ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanılır. Bir sorumluluk reddi beyanı olarak, bu prosedür yönergelerinin bu sisteme özgü bileşenleri vardır; Ancak, bu protokolün genelleştirilebilirliği hakkında bir tartışma için tartışmaya bakın. Amaç, davranışsal prosedürleri, bu prosedürleri gerçekleştirmek için tipik zaman çizelgesini ve farelerin basit bir doğrusal yolda koşmaları için eğitim başarı oranını ana hatlarıyla belirtmekti.

İkincisi, farelerde bu paradigma içinde karmaşık labirent görevlerinin uygulanmasına ilişkin dokümantasyon eksikliği devam etmektedir. Sıçanlarda karmaşık sanal tahliller geliştirilmiştir¹¹. Bununla birlikte, fareler karşılaştırıldığında görme keskinliğini azaltmıştır¹⁶ ve genellikle karmaşık görevlerde daha kötü performans gösterir¹⁷. Bazı araştırmalar kanıt birikimi veya mekansal yenilik¹⁸ gibi belirli görevlere odaklanmış olsa da, buradaki odak noktası, farelerin VR ortamlarında karar verme paradigmalarına katılmaları için gerekli eğitim metodolojilerini aydınlatmaktı. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, farelerin yalnızca ödüllendirilen kolun rengini/parlaklığını (siyaha karşı beyaz) ödülle ilişkilendirmeyi öğrenmekle görevlendirildiği bir sinyal ayırt etme görevi tasarlandı ve bu, Y-labirentinin seçim noktasında siyah kolun seçilmesiyle elde edildi ve her denemede doğru kol randomize edildi. Bu görev, sanal ipuçlarıyla etkileşim gerektirecek ve farelerin algısal ayırt etme yetenekleri hakkında fikir verecek şekilde tasarlanmıştır.

Özetle, bu çalışma, farelerde VR paradigmalarını kullanmak için kapsamlı eğitim protokolleri sağlayarak ve bu çerçevede karmaşık karar verme görevleri için metodolojileri açıklayarak deneysel davranışsal sinirbilim alanındaki kritik boşlukları ele almaktadır. Bu çalışma, önceki araştırmalardan ve yenilikçi deneysel tasarımlardan elde edilen içgörülerden yararlanarak, araştırma uygulamalarını kolaylaştırmayı ve davranışın altında yatan sinirsel mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmeyi amaçlamaktadır. Aşağıdaki bölümlerde deneysel prosedürler ve sonuçlar daha derinlemesine incelenecek ve bulgular tartışılacaktır.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, NIEHS Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen protokollere sıkı sıkıya bağlı kalınarak yürütüldü ve etik standartlara ve refah yönergelerine uyum sağlandı. Çalışma için yaklaşık 8 haftalık C57BL / 6Tac fareleri kullanıldı.

1. Kafa çubuğu implantasyonu için cerrahi

1. Ameliyat hazırlığı
   1. Kişinin kohortu için istenen miktarda fare elde edin, ideal olarak kafa çubuğu implantına müdahaleyi en aza indirmek için bunları ayrı ayrı barındırın, ancak bu isteğe bağlıdır¹⁹. Bu çalışmada, üç erkek ve üç dişi fareden oluşan bir örneklem büyüklüğü kullanılmıştır (başlangıçta dengelidir, ancak bir erkek, topun üzerinde koşmayı başaramadıktan sonra antrenmanın başlarında dışlanmıştır)
   2. Malzeme Tablosunda belirtilen malzemeleri, çalışma tasarımının özelliklerine göre ayarlayarak edinin.
   3. Farelerin satın alınmasından sonra, bireysel tanımlayıcıları belirleyin ve kesin tanımlamayı sağlamak için kuyruk dövmeleri veya kulak deliği zımbaları uygulayın. Su kısıtlama prosedürü için gerektiği şekilde ağırlıklarını sistematik olarak kaydetmek için kapsamlı bir günlük oluşturun.
2. Anestezi uygulaması
   1. Uygun şırıngalar, ısıtma yastığı, metal eşyalar (cımbız, mikro makas ve kanama durdurucular gibi), iyot solüsyonu, göz kayganlaştırıcı ve salin ve hidrojen peroksit için beherler dahil olmak üzere tüm cerrahi aletlerin hazır olduğundan emin olun. Steril koşulları sağlamak için tüm cerrahi ekipmanları sterilize edin ve tüm cerrahi aletleri bir otoklav kullanarak sterilize edin.
   2. Ameliyata devam etmeden önce, farelerin hassas ağırlık ölçümlerini yapın ve ısıtma yastığını 34 °C'ye kadar etkinleştirin. Gerekli tüm bilgileri kurumunuzun laboratuvar/cerrahi not defterine kaydedin. Oksijen ve izofluran tank seviyelerinin yeterliliğini doğrulayın ve kesintisiz cerrahi prosedürleri kolaylaştırmak için gerekli tüm malzemelerin mevcudiyetini onaylayın.
   3. Fareyi tırnağın ve anesteziyi indüklemek için %4 izofluran ve 3 L/dk'lık bir oksijen akış hızı alan küçük hayvanlar için tasarlanmış bir buharlaştırıcıya bağlı bir nosekon içine yerleştirin. Potansiyel olarak zararlı atık gazları yakalamak için bir çöpçü kullanın (önerilir).
   4. Oküler kuruluğu önlemek için farenin gözlerine burun altındayken Petrol oftalmik veteriner merhemi uygulayın. Başlangıçta her göze tek bir damla uygulayın ve gerekirse tekrar uygulayın. Periyodik kontrol ile her zaman bu kayganlaştırıcının bir tabakasını koruyarak gözlerin sürekli korunmasını sağlayın.
   5. Kafatasının kafa çubuğuna yapıştırılacağı alanı tıraş ederek farenin kafasındaki cerrahi bölgeyi (Şekil 1A) hazırlayın.
   6. Farenin kesici dişlerini burun konisinin altındaki stereotaksik aparatın içine yerleştirin, oksijen akış hızını 1 L / dk'ya ayarlayın ve buharlaştırıcıdan %1-2 izofluran uygulayın. Valfleri ayarlayarak ve buna göre indüksiyon nosekon ile stereotaksik aparat arasında geçiş yaparak uygun anestezi akışını sağlayın. Farenin arka bacağını uzatın ve ayak parmağına sıkı bir baskı uygulayın. Ayak refleksif bir geri çekilme yanıtı göstermiyorsa, bu anestezinin etkili olduğunu gösterir. Solunum kontrolü ile birlikte her 15 dakikada bir tekrarlayın.
   7. Kulak kanallarına cerrahi stabilite çubukları takarak farenin kafasını yerine sabitleyin ve ameliyat sırasında olası kafa hareketlerini en aza indirin.
   8. İnsizyon veya enjeksiyon yapmadan önce, başın üst kısmındaki traşlı cerrahi alanı iyot antiseptiğine batırılmış bir çubukla ovarak sterilize edin. Bu aşamadan itibaren, aseptik koşulları korumak için steril eldivenler kullanın.
3. Enjeksiyon uygulaması
   1. Deri altından 25G iğne ile 0.05 mL bupivakain (lokal analjezi) kafa derisindeki cerrahi insizyon bölgesine enjekte edin.
   2. Deri altına 25 G'lik bir iğne ile interskapular bölgenin bir tarafına 1 mL salin (hidrasyon) enjekte edin.
   3. Deri altından 0.05 mL buprenorfin (tüm vücut analjezisi) 25G'lik bir iğne ile interskapular bölgenin karşı tarafına enjekte edin.
4. Kafatasını açığa çıkarmak
   1. Kafatasının interfrontal ve internazal dikişlerinin üzerinde, kaş sırtının hemen üstünden başlayıp oksipital çentiğin arkasına kadar uzanan bir cilt kesisi oluşturmak için mikro makas kullanın (Şekil 1A).
   2. Cildin sol ve sağ kanatlarını tutmak için kanama durdurucuları kullanın ve kafatasını açığa çıkarın.
   3. Sabitlenmiş cilt kıvrımları arasındaki kafa derisindeki bağ dokusunu çıkarmak için kuru bir pamuklu çubuk kullanın.
   4. Saç derisini ovalamak için hidrojen peroksit ile ıslatılmış (ancak doymamış olan) bir pamuklu çubuk kullanın, dikişlerin görünürlüğünü sağlayın ve çevredeki dokuya hidrojen peroksit almamaya dikkat edin.
   5. Hem bregma hem de lambda belirgin bir şekilde görünene ve kafa derisi iyice temizlenene kadar 1.4.3 ve 1.4.4, 2x-3x adımlarını tekrarlayın.
5. Cerrahi vida implantasyonu
   1. Diş yapıştırıcısı için yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak ve kafa çubuğunun stabilitesini artırmak için bir vidayı bregma'nın arkasına ve diğerini lambda'nın önüne yerleştirerek kafatasına iki vida takın (Şekil 1B). Vidaların konumunu bregma'dan belirli bir mesafedeki hedeflere yerleştirin. Bir vidanın sola ve diğerinin sağa yerleştirildiğinden emin olun (yani, Ön-Arka (AP) +1.00, Medial-Lateral (ML) -1.00 ve AP -3.00, ML +3.00), vidalar arasında kafa çubuğunun yerleşimine uyum sağlamak ve koordinatları ayarlamak için yeterli boşluk olduğundan emin olun ve gerekli.
   2. Hedef pozisyonları delin, delmenin kafatası kemiği ile sınırlı olduğundan ve beyin dokusuna nüfuz etmediğinden emin olun.
   3. Bir tornavida kullanarak vidanın kabaca yarısını yerine vidalayın. İkinci vida için tekrarlayın.
6. Head-bar implantının takılması
   1. Diş çimentosunu karıştırın ve içbükey yüzeye odaklanarak baş çubuğunun alt tarafına uygulayın ve kafatasının interfrontal sütürü boyunca uygulayın.
   2. Baş çubuğundaki diş çimentosu ile sütür üzerindeki diş çimentosu arasındaki yapışmayı kolaylaştırmak için baş çubuğunu interfrontal sütürün üzerine yerleştirin. Sertleşene kadar yaklaşık 5 dakika boyunca istenen açıda elinizle güvenli bir şekilde yerinde tutun. Gerektiği kadar ek diş çimentosu uygulayın. (Şekil 1C-E)
7. Cildi baş çubuğunun üzerine yeniden takma
   1. Kanama durdurucuları serbest bırakın ve iki deri kanadını kurutulmuş diş çimentosu ile sabitlenmiş kafa çubuğu üzerinde yeniden birleştirmek için cımbız kullanın. Ön insizyon bölgesinden başlayıp posterior insizyon bölgesinde sona erecek şekilde, kafa derisinin sol ve sağ kısımlarını baş çubuğu üzerinde yavaşça birbirine yapıştırarak cildi hassas bir şekilde birbirine sabitlemek için topikal doku yapıştırıcısı kullanın.
   2. Fareyi cerrahi stabilite çubuklarından ve burun konisinden serbest bırakmadan önce cerrahi alanın yeniden kapatıldığını doğrulamak için topikal doku yapıştırıcısının sertleşmesine izin verin.
   3. Fareyi tek başına yerleştirilmiş bir kafese aktarın ve 37,5 °C'de bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
   4. Bilinci yerine gelene kadar fareyi herhangi bir rahatsızlık belirtisi veya solunum düzensizliği açısından dikkatlice izleyin. Fareyi sternal yaslanma halini yeniden kazanana, uyanıklık sergileyene ve yürüyene kadar gözetimsiz bırakmayın.
   5. Cerrahi prosedürleri takiben, farelerin 1 haftalık bir dinlenme periyodundan geçmesine izin verin. Ağırlıktaki kayda değer dalgalanmaları tespit etmek ve ele almak için fareleri günlük olarak izleyin. İyileşmeye yardımcı olmak için ameliyattan 3 gün sonra fareler için püre sağlayın. Kafa çubuğuna karışmayı önlemek için bu fareleri ayrı ayrı barındırın.

2. Sıvı kısıtlaması

NOT: Su kısıtlaması, farelerde susuzluk durumuna neden olarak sıvı ödülleri için motivasyonlarını artırır. Bununla birlikte, fare sağlığının korunmasını sağlamak için titiz bir uygulama gereklidir²⁰.

1. Ameliyat gününden 1 hafta sonra, fareler için temel ağırlıkları belirleyin.
2. Küçük bir Petri kabının (60 mm x 15 mm) bir parçasını içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde kafes tabanına bantlayın, daha küçük bir Petri kabını (35 mm x 10 mm) içbükey Petri kabının düz yüzeyinin ortasına kadar bantlayın zemine bantlanmış olarak, başka bir küçük Petri kabı (60 mm x 15 mm) su haznesi görevi görmek üzere orta kabın düz yüzeyinin üzerine bantlanmış olarak (Şekil 2).
3. Üst kabın yüksekliğinin, farelerin suya kolay erişmesine izin verirken yatak malzemesinden kontaminasyonu önlediğinden emin olun. Günlük su ödeneği hacmini bir pipet kullanarak rezervuara ekleyin.
4. 1. günde, farelere 100 g vücut kütlesi başına 15 ml su dozu verin.
5. 2. günde, farelere 100 g vücut kütlesi başına 10 mL su dozu verin.
6. 3. günde, farelere 100 g vücut kütlesi başına 5 mL su dozu verin. Fareler, vücut ağırlığından bağımsız olarak çalışma boyunca günde en az 1 mL su almalıdır.
   NOT: Araştırmacılar, minimum hacmi tüm deneklere eşit olarak uygulamayı tercih edebilirler, ancak bu tür ayarlamalar dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
7. Çalışma süresi boyunca su tahsisi süresi boyunca 100 g vücut ağırlığı başına 5 mL'de tutarlı bir dozaj tutun (veya tercih edilirse tek tip 1 mL su tahsisi)
   NOT: Farelerin bir VR deneyi yapmadığı zamanlarda (yani hafta sonu) farelere haftada 1-2 gün suya ad libitum erişim sağlanmalıdır. Bu, doğal hidrasyon seviyelerinin restorasyonunu kolaylaştıracaktır. Farelerin kaydedilen başlangıç ağırlıklarının %90'ının altına düştüğü durumlarda, başlangıç ağırlıklarının %90'ına ulaşana kadar ad libitum su erişimine geçirilmelidirler. Kaydedilen başlangıç ağırlıklarının% 80'inin altına düşen fareler etik olarak ötenazi yapılmalıdır.
8. Deneyin doğru bir şekilde yürütülmesi için gerekli olan doğal susuzluk davranışlarına olası müdahaleyi azaltmak için davranışsal değerlendirmeden en az 30 dakika sonra günlük su dozlarını uygulamayı erteleyin.
   NOT: Bir denemeden hemen sonra likit ödüller sağlamak, farelerin performansını istemeden etkileyebilir, çünkü fareler anında bir ödül almayı bekleyebilir ve potansiyel olarak görev katılımını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, deneme sonrası suya erişimin geciktirilmesi, anında ödül dağıtımına alışmayı önler ve deney düzeneğinin bütünlüğünü korur.

3. Sistem kurulumu

1. Ekipmana aşinalık: Donanım bileşenleri ve VR davranış sistemleriyle ilgili diğer hususlar için aşağıdaki adımlara bakın.
   Karşılaştırılabilir sistem kurulumlarına protokol genellenebilirliğinin incelenmesi için tartışma bölümüne bakın.
   1. Tamamen sürükleyici sanal ekran veya kubbe: Bu sanal ekran, özelleştirilebilir bir sanal ortamda bir hayvan için tam daldırma sağlar. Sanal ortamdaki hareket, küresel koşu bandındaki hareket ile senkronize edilir.
   2. Sıvı ödül sistemi: Sıvı ödül sistemi, bir görev başarıyla yürütüldüğünde ödül çözümünü fareye uzanan plastik kaplı metalik bir tüp aracılığıyla yönlendiren peristaltik bir pompa kullanılarak sıvı takviyenin (su veya şekerli su) verilmesi yoluyla çalışır. Bir deneme sırasında bir fare tarafından elde edilen ödüllerin miktarını izleyen sensörler içerir.
      1. Ödül tüpünü etil alkol veya alternatif bir temizlik maddesi kullanarak haftalık olarak temizleyin. Bunu yapmak için, sıvı ödülünün verilmesine benzer şekilde 2-5 mL temizlik maddesini tüpten yıkayın, ardından eşit hacimde su ile karşılaştırılabilir bir yıkama yapın.
      2. Deneye başlarken, ödül tüpünü belirli bir süre boyunca aktive ederek ve dağıtılan sıvının hacmini ölçerek ödül tüpünden sıvı ödülünün dağıtım oranını belirleyin. Bu prosedür, peristaltik pompanın sıvı dağıtım hızının belirlenmesini sağlar. Bu araştırmada, yaklaşık 0.0083 mL / s'lik bir dağıtım oranı kullanılmıştır.
         NOT: Çoğu sistem, davranışın yürütülmesi ile ödülün serbest bırakılması arasındaki süre için programlanabilir ayarlar sunarak, deneme başına amaçlanan ödül hacmine dayalı olarak çalışma protokolünün hassas bir şekilde planlanmasını sağlar. Kullanılan miktar, farenin ödülü tüketmesi için yeterli zamana izin verdiği için yeterli olarak belirlendi ve hacmi motive edici görünüyordu.
      3. Bazı protokoller, ödül dağıtımını başlatmak için farenin ödül musluğunu yalamasını gerektirebilir. Burada kullanılan görev türleri için bu işlevsellik kullanılmamıştır, yalnızca istenen davranışın başarılı bir şekilde yürütülmesine bağlı ödüller verin (yani, y labirentinde doğru kolu seçmek). Bu, yalama eğiliminin yeterince belirlenmediği ve ilk yalamanın meydana gelme olasılığının daha düşük olduğu eğitimin erken dönemlerinde başarısızlıkların önlenmesine yardımcı olur. Ayrıca, bazı koşullar altında seyir performansından ayrılabilen ödül beklentisinin ölçülmesine de izin verebilir¹¹.
      4. Sıvı kısıtlaması kullanan bazı deneyler, ödül tüpü aracılığıyla standart su kullanımını tercih ederken, burada edimsel paradigma içinde ek bir motivasyonel uyaran olarak şekerli su (%10 sükroz v/v) kullanın. Özellikle, şekerli suyun eklenmesiyle birden fazla deneysel kohortta gelişmiş performans gözlendi.
   3. Strafor top: Bu top küresel bir koşu bandı görevi görür. Alttan hava ile yastıklandığında, fareleri topun üzerinde rahatça koşmaları veya yürümeleri için eğitin. Mesafe ve hız hakkında veri toplayan hareket izleme sensörleri ile donatılmış bir top tutucunun üzerine yerleştirin.
   4. Baş tutucu: Baş çubuğunu tutucuya taktıktan sonra VR ekranıyla görsel hizalamayı sağlayarak cihazı farenin arkasına yerleştirin. Bu aparat, fareyi başa sabit bir pozisyonda tutmak için çok önemlidir, böylece özellikle sistem optik görüntüleme veya elektrofizyolojik tekniklerle birlikte kullanıldığında hareket artefaktlarını azaltır.
   5. Hava akışı donanımı: Topun üzerinde koşan fareler için elverişli ağırlıksız bir ortam oluşturmak için basınçlı hava kaynağından topa giden hava akışını yapılandırın. Bu kurulum, topa uygulanan hava basıncı üzerinde hassas kontrol sağlamak için bir akış regülatörü gerektirir. Top, minimum hava beslemesi ile ağırlıksız ortamda verimli bir şekilde çalışır. Bu nedenle, sistem kurulumu sırasında, topun tutucu içinde düzgün ve engelsiz hareketini kolaylaştırmak için gereken minimum hava miktarını belirleyin. 10-20 L/dk arasında bir akış önerilir.
2. Yazılım kurulumu: Sistemin çalışmasıyla ilgili özel ayrıntılar için aşağıya bakın.
   NOT: Video oyunları^21'in tasarımına çok benzer şekilde, sanal dünyaların mimarisi, harici bir denetleyici, programlanabilir bir gezilebilir ortam ve dinamik işlevleri tanımlayan bir durum diyagramı içeren bir zamanlama dosyası gibi temel öğeleri bütünleştirir. Bu bileşenler, araştırma çalışmalarında yer alan denekler için uyumlu bir etkileşimli deneyim oluşturmak için sinerjik olarak birleşir. Yazılımın operasyonel etkinliği, belirlenen klasörler içindeki hassas dosya organizasyonuna bağlıdır. Bu açıklama, önceden hazırlanmış şablonları doldurmak için gereken ana adımları ana hatlarıyla açıklayarak mevcut dosyalarda kolay ayarlamalar yapılmasına ve bunların yeni sürümler olarak kaydedilmesine olanak tanır. Bu yeni versiyonlar daha sonra çalışmanın temelini oluşturacaktır.
   1. İşletimsel bir sanal manzara yapılandırmak için aşağıdaki üç dosyayı birlikte kullanın.
      1. XML dosyaları: Bu dosya biçimi, kullanıcılara gökyüzü, zemin ve duvarlar gibi çeşitli öğelerin fotoğraf dokusunu değiştirme yeteneği sağlar. Görüntüler için kullanılan dosyaları VR klasörünün Veri alt klasörüne yerleştirin. Bunları kullanarak labirentin boyutlarını belirtin ve farenin labirent içindeki başlangıç konumunu belirleyin. Bu dosyaları kullanarak labirent içindeki belirli düğümlerde 3B nesneler (görsel ipuçları) tanımlayın. Bir metin düzenleyici kullanarak bu dosyaları değiştirin.
      2. XLSX dosyaları: Bunlar, uyumlu ve etkileşimli bir sanal sunum oluşturmak için üç dosya türünü de (XML, XLSX ve XAML) birlikte yapılandıran komut dosyaları olarak çalışır. Duyarlılık kazanma, hangi verilerin ayıklanması ve bir deney için hangi dosyaların birlikte gruplandırılması gibi VR'yi ve aksesuarlarını çalıştıran deneysel rutinleri tanımlamak için bu dosyaları kullanın.
      3. XAML dosyaları: Yazılım uygulaması, akış şemalarının kullanımı yoluyla deneysel programların oluşturulması için grafiksel bir arayüz sağlar. Deneme için zamansal parametrelerin tanımlanmasını, deneme tamamlandıktan sonra ışınlanma kontrollerini ve deneme çerçevesi içindeki dijital çıktılar için aktivasyon zamanlamasını kolaylaştırır.
   2. Sistem çalışırken verilerin alınması ve sistemin kullanıcı kontrolü için aşağıdaki uygulamaları kullanın.
      1. [Uygulama] VR: Temsili manzarayı gösteren .XML dosyasıyla ilişkilendirilmiş olarak, sanal manzarayı statik modda monitörlerde önizlemek için dosyayı açın. Dinamik etkileşim için, eşleştirilmiş yapılandırmayı açın. Kontrol uygulamasındaki XLSX dosyası.
      2. [application] control: .XSLX dosyasıyla ilişkilendirilmiş, sistemle ilişkili aksesuar aygıtları görmek için bu uygulamayı açın. Ödül tüpünü manuel olarak uzatabilir ve geri çekebilir, sıvı ödül dağıtabilir ve buradan gerçek zamanlı veri toplamayı görüntüleyebilirsiniz.
      3. [application] schedule designer: Bu uygulama, deneme içinde olay tetikleme için bir zamanlama oluşturmak üzere XAML dosyalarını ayarlama yeteneği sağlar. Örneğin, ödüllerin dağıtılma süresini belirlemek ve fareler için denemeler arasındaki molaların süresini tanımlamak için özelleştirilebilir bir tetikleyici tasarlayın.
3. Örnek Başlangıç: Adım 3.2.1.1-3.2.1.3'teki ayarlanabilir bileşenlere dayalı olarak çalışma protokolünün nasıl görüneceğine karar vererek başlayın. Edimsel bir protokol açıkça tanımlandıktan sonra, aşağıdaki adımları izleyerek VR sistemiyle önceden ayarlanmış olarak gelen şablon deneylerinden birini açın.
   1. Veri alt klasörüne açılan VR uygulamasını açın. Oluşturulan sanal manzarayı bir XML dosyası olarak kaydedin. Bu dosyayı açın ve sanal manzara VR monitörlerinde görünmelidir.
   2. Kontrol uygulamasını açın ve ekranın sağ üst köşesindeki Klasörü aç simgesine gidin. Tıklayın Configs klasörünü getirmesi gereken Simge, burada karşılık gelen . XLSX deneysel konfigürasyonu yer almaktadır. Açın. VR uygulamasında açılan .XML dosyasıyla aynı ada sahip XLSX dosyası. Genişletilebilir ödül cihazı için pompa ve motor gibi tanımlanmış sistem aksesuarları artık uygulama içindeki kontrol sekmesi altında görülebilir.
   3. Bu iki uygulama arasındaki koordinasyon etkileşimli bir sanal manzara oluşturulmasını sağladığından deneysel denemeyi başlatın. Sonuç olarak, bu entegrasyon, XY düzlemindeki mesafe ve zaman damgalarıyla ödüllerin toplanması dahil olmak üzere temel verilerin izlenmesini kolaylaştırır.
4. Veri toplama: Zaman damgalı konumsal veriler ve ödüller olan en değerli davranışsal verileri sistemden çıkarın. Bu veriler günlük dosyaları olarak ayrı ayrı kaydedilir.
   1. Pozisyon verileri: Bunu elde etmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
      1. Farelerin zaman damgalı XY konum verilerini elde etmek için, önce istenen veri toplama labirentinin elektronik tablo dosyasını açın. Tablo 1'de, WriteVRAndCamInfoToFile komutunu A sütunundaki diğer hücrelerin altındaki hücrelerden birine yerleştirin. Artık konumsal veriler, bir denemeden sonra otomatik olarak configs klasörüne tarihli bir CSV dosyası (Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv olarak adlandırılır) olarak kaydedilecektir.
      2. Bir denemeden sonra pozisyon verilerini dışa aktarmak için kontrol uygulamasını kapatın ve veriler tarihli bir CSV dosyasına kaydedilecektir. Bu dosya, belirli bir gün için tüm belirli verileri içerecektir, bu nedenle her bir konunun topa ne zaman yerleştirildiğini ve toptan ne zaman çıkarıldığını manuel olarak not etmeye dikkat edin. Dosyayı açın ve Unicode UTF-8 karakter kümesini kullanarak içe aktarın. Sütun A, DateTime olarak etiketlenmiştir, A sekmesine sağ tıklayın ve Hücreleri Biçimlendir'e tıklayın. Saate gidin ve AA/GG/YYYY SS:DD: SS seçeneğini tıklayın. Şimdi, daha fazla veri analizi için her sistem olayı kronolojik olarak kataloglanacaktır.
   2. Ödül verileri: Bunu elde etmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
      1. Pompa aktivasyonu (ödül dağıtımı) ile ilgili veriler otomatik olarak sisteme tarihli günlük dosyaları olarak kaydedilir, bu nedenle konum verileri için olduğu gibi bir komut girmeye gerek yoktur. Bunlara erişmek için configs klasörünün Günlük Dosyaları alt klasörüne gidin.
      2. Verileri bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarmak üzere ödül verilerinin konum verileri için 3.4.1 adımını tekrarlayın. Configs klasörünü açın ve klasörde görüntülendiğinde tarihli ödül dosyasını (Corridor- AA.DD.YYYY veya Corridor_Linear_Run- AA.DD.YYYY olarak adlandırılır) seçin. Bu, farelerin ödülleri elde ettiği tarih ve saati sağlayacaktır ve bu, kullandıkları paradigmaya bağlı olarak daha fazla veri analizinde kullanılabilir.

4. Davranışsal Görevler

NOT: Davranışsal sinirbilimdeki yerleşik metodolojilere uygun olarak, formüle edilmiş görevler ödüle dayalı bir ilişkisel öğrenme tekniği kullanır. Hayvanlar, belirli davranışları güçlendirmek için anında ödüller kullanarak, VR'nin ışınlanma yeteneği tarafından kolaylaştırılan tekrarlayan görevleri yerine getirmek için etkili bir şekilde eğitilir. Sanal bir davranışsal çerçeve içinde, ışınlanma işlevi, farelere fiziksel manipülasyonla ilişkili stres olmadan görevlere katılma yeteneği verir ve aynı zamanda benzer gerçek dünya görevleri için gerekli kurulum süresini azaltır. Eğitim oturumları sırasında, deney ortamında loş kırmızı tepe aydınlatması kullanın. Bu önlem, farelerde kırmızı ışığa karşı azalan görsel algısal hassasiyet nedeniyle önerilir, bu da beyaz ışık kullanımının aksine sanal gerçeklik (VR) ekranlarının algısına olası müdahaleyi azaltır²².

1. Alışkanlık
   1. Doğru zamanlanmış fizyolojik motivasyonu kullanarak yalama tüpünü ödülle ilişkilendirmek için küresel koşu bandına alışmalarıyla aynı anda sıvı regülasyonuna alışmalarıyla aynı anda başlayın. Lineer parkur eğitimine başlamadan önce üç günlük bir alışma süresi önerilir.
   2. 1^{. gün,} tartıldıktan sonra fareleri 5 dakika boyunca tutun. Bu etkileşim sırasında, fareler kafesindeyken baş çubuğu implantını nazikçe kavramanız ve bu tür bir manipülasyona aşinalık yaratmanız önerilir. Deneysel denemelerin gerçekleşeceği mekansal ortamı tahmin etmelerini sağlamak için onları bu gün VR'nin bulunduğu alanla tanıştırın. Bu ilk alışma günü, 100 mg vücut kütlesi başına 15 mL'lik sıvı regülasyonunun başlamasıyla aynı zamana denk gelir.
   3. 100 mg vücut kütlesi sıvı düzenleme adımı başına 10 mL'ye geçişle uyumlu olan 2^{. günde} , fareleri tekrar 5 dakika boyunca tutun. Kafesin içindeyken baş çubuğunu tekrar tekrar nazikçe kavramaya devam edin. Farelerin 5-20 dakika boyunca küresel koşu bandına alışmalarına izin verirken, sonsuz tekrar eden bir pistte veya yazılım programı etkinleştirilmeden kafa çubuğunu tutucuya takın. Bu, başa sabitlenmiş duruma adaptasyonlarını kolaylaştırır. Farelerin bu süre zarfında atık salgılayabileceği ve bu durumun tipik olarak birbirini izleyen seanslarda azaldığı tahmin edilmelidir.
   4. Sıvı regülasyon paradigmasının son gününe (100 mg vücut kütlesi başına 5 mL) karşılık gelen 3^{. günde} , fareleri 5 dakika boyunca tutun. Ardından, onları hava yastıklı küresel koşu bandına güvenli bir şekilde takın ve ödül tüpü aracılığıyla sıvı ödüllerle tanıştırın.
      1. Yalama musluğunu saf farelere tanıtmak ilk başta kafalarını karıştıracaktır, bu nedenle farenin tüpten içmeleri gerektiğinin farkında olduğundan emin olun.
   5. Çok zorlayıcı olmadan, aşağıdaki fare yönergelerinin konumlandırmasını uygulayın ve farenin top üzerindeki konumunu, ödülü onlara rahat bir şekilde iletecek şekilde tüpe göre kişiselleştirin. Başlarken, farelerin tüpten içtiğinden emin olun; Bu, çoğu farede, içmek için sıvı sunulduğunda doğal olarak su kısıtlı koşullar altında meydana gelecektir.
2. Farelerin konumlandırılması
   1. Ön konumlandırma: Fareyi topun üzerine yerleştirmeden önce, ortalanmış ödül tüpünü ucunda küçük bir ödül damlası olacak şekilde uzatın. Fare kafası sabitlendikten sonra tüpün yanlışlıkla çok ileri uzatılmasından kaynaklanan olası yaralanmaları önlemek için fareyi topun üzerine yerleştirmeden önce ödül tüpünü uzatın. Ödül tüpünü küresel koşu bandının 5-15 mm üzerine yükseltin, böylece musluğu yalamak için başın doğal bir öne bakan duruşu gerekir.
   2. Kafa sabitleme: Farenin kafasını sabitlemek için, fareyi küresel koşu bandının işleyicinin baskın tarafına yerleştirin. Ardından, işleyicinin baskın elini kullanarak fareyi baş çubuğundan baş sabitleme platformuna doğru çekin. Kafa çubuğunu sabitlemek için tasarlanmış yuvaya yerleştirin, ardından işleyicinin baskın olmayan elini kullanarak kafa çubuğunu yerine oturtun.
   3. Topun üzerindeki konum: Her fare için küresel koşu bandındaki yerleşimi kişiselleştirin, ancak ödülü tatmak için motivasyonu sağlamak ve genel stres seviyelerini en aza indirmek için aşağıdaki gereksinimleri karşıladıklarından emin olun.
      1. Farenin orta sagital düzlemini küresel koşu bandının merkezi ile hizalayın. Baş çubuğunun düz olmadığı durumlarda, kafa çubuğu yerine farenin orta sagital düzleminin yerleşimin merkezi ile aynı hizada olduğundan emin olun. Görsel netlik için Şekil 3C'ye bakın.
      2. Farenin arka pençelerinin küresel koşu bandının tepesinden en fazla 11 cm uzakta olduğundan ve başın tepenin arkasında olduğundan emin olun. Dört pençenin de koşu bandına temas ettiğinden ve fare dinlenirken karnın koşu bandına dokunabildiğinden emin olun; Bu, koşmak için topun uygun yürüyüşünü ve dengesini destekleyecektir.
      3. Fareler koşmadığında, buna top reddi denir. Fareler donmaya devam ederse ve kaçmaya çalışmazsa, muhtemelen aşırı endişe yaşıyorlar ve araştırmacı onları deneyden çıkarmayı seçiyor. Bu çalışmada, verilerden dışlanmayı belirlemek için 5 günlük top reddine ilişkin nicel bir eşik kullanılmıştır.
   4. Yan önyargı: Fareler eğitim rutinine ilk alışmaya başladıklarında, bir tarafı diğerine tercih edeceklerdir. Bu, görev performansını etkileyebilir, bu nedenle herhangi bir yan tercihin, hayvanın topa nasıl monte edildiğindeki asimetriden kaynaklanmamasına dikkat edin. Burada kullanılan y-labirent görevi, özellikle hayvanın ödül dağıtımını optimize etmek için hem sağ hem de sol seçimler yapmasını gerektirir, bu da yan tercihlerin üstesinden gelmeyi kolaylaştırır.
   5. Ödül musluğu: Bu yaklaşım, farenin ağzı musluğun ucuna neredeyse değene kadar uzatılmış yalama tüpüne doğru yönlendirildiği ve böylece ödülün doğru bir şekilde verilmesini sağladığı, öpücük yöntemi olarak adlandırılan nazik bir manevrayı içerir. Fareler ödül aldığında uzatılmış ödül tüpünün süresini 1 saniyeye ayarlayın ve fareye damlacığı tamamen tüketmesi için yeterli zaman tanıyın. Her bir fare için boyut ve tercih edilen konumlandırma farklı olabileceğinden, her fare için yalama ağzı konumunu kişiselleştirin. Yalama standardizasyonu için ödül tüpünün tüm denemeler boyunca ortada kaldığından emin olun; Fare, sanal labirent tasarımından bağımsız olarak ödülü her zaman aynı fiziksel konumda almayı beklemelidir.
      NOT: Bu sürenin belirlenmesi araştırmacının takdirine bağlı olsa da, bu bulgular bu zaman diliminin, tüpün geri çekilmesinden önce fare tarafından tam ödül alımını kolaylaştırmada etkili olduğunu göstermektedir. Şekil 3B , yerleştirme için tercih edilen bir konumlandırma örneğini göstermektedir.
   6. Doğrusal yol: Benzer metodolojileri kullanan önceki çalışmalarla tutarlı olarak, iki temel sorguyu araştırmak için doğrusal bir izleme görevi kullanın: fareleri düz bir koridoru geçmek için eğitmek için gereken süre ve fareler tarafından ödül almanın beklenen başarı oranı.
      1. Farelerin hem sıvı kısıtlama paradigmasına hem de deneysel donanıma alıştığından emin olun.
      2. 1 m uzunluktan başlayan doğrusal bir sanal koridor boyunca hareket etmek için günlük 30 dakikalık bir seans gerçekleştirin. Koridorun sonuna ulaştıktan ve şeker damlası ödülünü aldıktan sonra, fareleri başlangıç noktasına geri ışınlayın.
      3. Daha uzun labirentlere (örneğin, 1 m, 2 m, 3 m) kritere dayalı bir ilerleme belirleyin. Arka arkaya 2 gün boyunca dakikada ortalama 2 ödül aldıktan sonra fareleri bir sonraki labirent uzunluğuna ilerletin (Şekil 4A).
      4. Ödülün alınmasıyla ilgili zaman damgalı verilerin günlük kayıtlarını ve daha fazla analiz için farelerin küresel koşu bandında kat ettiği mesafeyi belgeleyin (Şekil 4B-D).
      5. 3 m'lik lineer pistlerde dakikada ortalama 2 ödül alan fareler için, onları lineer pist paradigmasında yetkin olarak işaretleyin. Farelerin karar verme gerektiren daha karmaşık davranışsal görevlere ilerlemeden önce bu aşamaya ulaşmaları önerilir.
   7. Karar Verme Gerektiren Karmaşık Davranışsal Görevler (Y-Labirenti): Bu aşama, karar verme gerektiren basit bir davranışsal görevden daha karmaşık bir davranışsal göreve ilerlemenin fizibilitesini araştırır. Bunu başarmak için, tasarlanmış bir sinyal ayrımcılığı Y-Labirenti görevi oluşturun.
      1. Bu Y-labirent paradigmasında ^23,24, farelerin iki kolun bir Y şekli gibi her iki yönde 45° uzandığı bir seçim noktasına doğru hareket ettiğinden emin olun. Labirentin başlangıç noktasından seçim noktasına ulaşana kadar dönüşü devre dışı bırakın, farklı renkte iki kol ve ardından farenin istenen yöne doğru dönmesine izin vermek için karar bölgesi içinde etkinleştirin.
      2. Ödül bölgesine giden kola girdikten sonra, dönüşü bir kez daha devre dışı bırakın. Siyah bir kol doğru yolu temsil ederken, beyaz bir kol yanlış yolu temsil eder. Fare görme keskinliğindeki potansiyel sınırlamalara uyum sağlamak için siyah kol ve beyaz kolu ipucu olarak kullanın, çünkü bunlar kolayca ayırt edilebilir, bu da görsel bilgi kullanımlarının en basit haliyle incelenmesini kolaylaştırır.
      3. Fareleri, bir şeker ödülü almak için siyah kola doğru gitmeleri için eğitin ve her deneme, farelerin başlangıç konumuna geri ışınlanmasıyla sona erer. Deneysel tasarıma, ödül konumunun sol ve sağ taraflar arasında rastgele bir şekilde karıştırılmasını dahil edin, böylece farelerin ödülü belirli bir taraf yerine görsel ipuçlarıyla ilişkilendirmesini sağlayın.
      4. Y labirentini kurmak için doğrusal koridorla aynı adımları kullanın. Y-labirent paradigmasındaki ilerleme kriterlerini doğrusal koridorunkilere yansıtın: her deneme 30 dakika sürer ve farelerin art arda 2 gün boyunca önceden belirlenmiş bir ödül eşiğine ulaşması gerekir. Y labirentindeki önceki pilot kohortların ortalama performansına dayalı olarak doğru bir şekilde elde edilen %70'lik bir ödül eşiği önerilir; şans eşiğinin (%50) üzerindedir ve farelerin görevi anladığını gösteren makul bir şekilde ulaşılabilir bir yüzdeyi temsil eder (Şekil 5A).
      5. Seçim noktasına ulaştığınızda, farenin doğru veya yanlış kollardan birini seçtiğinden emin olun. Kolun sonunda, labirenti 30 dakikalık bir zaman dilimi içinde tekrarlamak için başlangıç noktasına geri ışınlayın.
      6. Bu yaklaşım, labirentlerin ayırt edilmesinin giderek daha zor hale geldiği görsel psikofizikten ilham alan bir yaklaşım kullandı. Y-labirent paradigmasındaki ilerleme için aşağıdaki açıklamayı takip edin.
         1. İlk Y labirentinde, labirentin seçim noktasında düz siyah beyaz kolları bulun. Fare, art arda 2 gün boyunca denemelerin %70'inde siyah kolu doğru seçtiyse, giderek daha zorlu ayrım görevleriyle bir sonraki seviyeye ilerletin. Bunu başarmak için, ilerlemenin her seviyesinde her kola kademeli olarak kontrast rengin %10'unu ekleyin. Örneğin, beyaz kolu %90 beyaz ve %10 siyahtan oluşacak şekilde değiştirin ve bunun tersi de geçerlidir, bu da her ilerlemede ayrımcılığı daha talepkar hale getirir.
            NOT: Artırma fikri, %50 beyaz/siyaha ulaşılabiliyorsa, kollar ayırt edilemeyecek kadar etkili bir kontrol olacaktır. Bununla birlikte, farelerin görsel olarak ayırt edebildiği en uzak oran %80:%20 idi (Şekil 5B).

Sonuçlar

Bu pilot çalışma, farelerin iki farklı görevde verimli bir şekilde eğitilmesi için metodolojilerin ana hatlarını çizmeyi amaçladı: basit bir koridor ve karmaşık bir karar verme görevi (Y-labirent görsel ayrımcılık görevi). Bu veriler, VR'de davranışsal eğitim için zamansal yönergelerin oluşturulması için temel oluşturdu.

Prosedürel adımlar, Şekil 1'de kafa çubuğunun cerrahi implantasyonunun ana hatlarıyla belirtilerek başlar. Bu implant, davranışsal değerlendirmeler sırasında farenin kafatasını stabilize etmeye hizmet eder, böylece özellikle elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri ile birlikte kullanıldığında nöral kayıtların hassasiyetini artırır.

Şekil 2 ve Şekil 3 , deneysel sistemin donanım bileşenlerini ve kurulumunu göstermektedir. Şekil 2 , bir Petri kabı çeşme yöntemi kullanan su dağıtım sistemini detaylandırmaktadır. Bu, 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabının içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde kafes zeminine yapıştırılmasını, daha büyük kabın ortasına içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde daha küçük bir 35 mm x 10 mm Petri kabının sabitlenmesini ve başka bir 60 mm x 15 mm Petri kabının içbükey tarafı yukarı bakacak şekilde su haznesi olarak hizmet etmek için daha küçük kabın üzerine yerleştirilmesini içeriyordu. Üst tabağın yüksekliği, farelerin suya kolay erişimini sağlarken yatak malzemesinden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için dikkatlice ayarlandı.

Şekil 3 , sistem donanımı ve fare konumlandırma yönergelerini sunar. Şekil 3A , merkezi olarak konumlandırılmış küresel bir koşu bandına sahip altı ekranlı bir diziye sahip VR kurulumunu göstermektedir. Şekil 3B , farenin koşu bandı üzerinde, baş doğal bir pozisyonda hizalanmış ve dört pençenin tümü yüzeyle temas halinde olacak şekilde en uygun yerleşimini göstermektedir. Şekil 3C , kafa çubuğuna göre doğru ve yanlış fare yerleşimini karşılaştırır ve farenin orta sagital düzleminin kafa çubuğunun kendisiyle hizalamak yerine ortalanması gerektiğini vurgular.

Şekil 4 , ilerleme için önceden tanımlanmış parametrelere dayalı olarak VR'de 1 m, 2 m ve 3 m dar koridorlar için beklenen öğrenme dönemlerini gösteren bir çizgi grafiği üzerinde ödül edinme eğrilerini sunmaktadır. Farelerin ilgili iz uzunlukları boyunca ortalama hızlarını göstererek, artan zorlukla orantılı görev öğrenme ve iyileştirmenin kanıtı olarak hızda kademeli bir artış gösterir. Farelerin doğrusal izler için kritere ulaşması için gereken ortalama gün sayısını gösteren bir çubuk grafiğin yanı sıra her bir iz uzunluğu için ortalama hızları gösteren bir çubuk grafik de gösterilir. Bunu takiben, fareler tarafından öğrenilen doğrusal iz görevinin ilerleyen aşamaları da gösterilmektedir. Bu görevler, fareler için uygun bir öğrenme eğrisi sağlarken akademik literatürde oluşturulan metodolojileri çoğaltmak ve seviyeler arasında ilerlemelerini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Son olarak, Şekil 5 , Y-Labirent göreviyle ilgili verileri sağlar. Şekil, düz siyah ve beyaz kollar arasında basit bir ayrımcılıkla başlayarak görevin ilerici doğasını göstermektedir. Bu ilk aşama, farelerin zıt görsel ipuçlarını ayırt etme yeteneğini belirleyen temel bir adım olarak hizmet eder. Görevin sonraki seviyeleri, her bir kola zıt rengin ek yüzdelerini dahil ederek artan karmaşıklığı ortaya çıkarır ve böylece farelerin ayırt etme yeteneklerini daha da zorlar. Görev zorluğunun kademeli olarak artması, düz siyah beyaz kollardan, bir rengin %90'ı ve diğerinin %10'undan oluşan kollara geçişle örneklendirilir. Özellikle, Şekil 5'te sunulan veriler, ayrımcılık doğruluğunun her ilerleme seviyesinde iyileşirken, bazı farelerin sürekli olarak bir görsel ayrım yeteneği eşiği gösterdiğini ve maksimum %80/%20 beyaz/siyah ayrımcılığına ulaştığını göstermektedir. Bu gözlem, Y-Labirenti görevi bağlamında farelerin görsel ayırt etme yeteneklerinin doğasında bulunan sınırlamaların altını çizerek, görevin fizibilitesi ve deneklerin bilişsel kapasiteleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Daha sonra, literatürdeki yerleşik metodolojilerle uyumlu olacak şekilde tasarlanan Y-labirent yolu görevinin ilerleyen aşamaları detaylandırılmıştır. Bu aşamalar, fareler için uygulanabilir bir öğrenme eğrisi sağladı ve seviyeler boyunca kademeli olarak ilerlemelerini destekledi.

Şekil 1: Kafa-çubuk implantasyonu için cerrahi talimatlar. (A) Kesi yeri farenin kafatası üzerinde işaretlenmiştir. (B) Vidalar, interfrontal sütürün 1 mm soluna, bregma'nın biraz altına ve interfrontal sütürün 3 mm sağına, lambdanın biraz üzerine yerleştirilmelidir. (C) Baş çubuğu interfrontal sütür boyunca yerleştirilmelidir. (D) Baş çubuğu implantının üzerine diş çimentosu uygulayın. (E) Diş çimentosu uygulamasından sonra kafa çubuğunun gerçek görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Petri kabı çeşme yöntemi kullanan su dağıtım sistemi. 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabı, kafes tabanına içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde sabitlendi. Daha küçük bir 35 mm x 10 mm petri kabı, daha büyük tabağın üzerine ortalandı ve başka bir 60 mm x 15 mm Petri kabı, bir rezervuar görevi görmek için içbükey tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirildi. Bu kurulum, suyun yatak takımları tarafından kirlenmemiş ve fareler tarafından erişilebilir kalmasını sağladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sistem donanımı ve fare yönergelerinin konumlandırılması. (A) Bu, kullanılan VR kurulumunu görüntüler. Ortada küresel koşu bandı ile altı ekranlı bir kurulum kullanıldı. (B) Küresel koşu bandında en uygun fare yerleşiminin yandan görünümü. Fare kafası doğal bir pozisyonda, dört pençe de küresel koşu bandı üzerindedir. (C) Farenin baş çubuğuna göre doğru ve yanlış yerleşiminin üstten görünümü. Doğru yerleştirme için, farenin orta sagital düzlemi, kafa çubuğunun kendisi yerine ortalanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Doğrusal iz verileri. (A) Sunulan veriler, her 30 dakikalık deneme süresi içinde toplanan günlük ödülleri göstermektedir. Fareler, art arda 2 gün boyunca dakikada ortalama 2 ödül elde ettiklerinde daha uzun parkur uzunluklarına ilerlediler ve toplam 60 ödül (eşik) elde ettiler. (B) Fareler görevde yeterlilik kazandıkça, hızları kademeli bir artış gösterdi, bu da ödül takviyesinin etkinliğinin bir göstergesiydi. Grafik, pistteki her farenin ortalama günlük hızını cm/s cinsinden göstererek, öğrenilen davranışta doğrusal bir ilerlemeyi tasvir eder. (C) Bu çubuk grafik, her bir farenin bireysel iz uzunluklarında yeterlilik kazanmak için harcadığı süreyi, her bir iz uzunluğu için gösterilen ilgili ortalamalar ve standart hata ile gösterir. (D) Bu çubuk grafik, her bir farenin çeşitli iz uzunluklarında elde ettiği ortalama günlük hızların ortalama ve standart hatasını gösterir. Neredeyse doğrusal ilerleme, koşu hızında öğrenilmiş bir gelişme olduğunu gösterir. (E) Bu, labirentin daha uzun bir versiyonuna ilerlemeden önce art arda 2 deneme günü 60 ödül gerektiren doğrusal yol görevinin ilerlemesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Y-Labirenti verileri. (A) Bu, Y-Labirenti ilerlemesinin farklı aşamalarında elde edilen ödüllerin dağılımını gösterir. Bu analiz, yalnızca doğrusal yolun tüm aşamalarını tamamlayan ve böylece hem erkek hem de kadın katılımcıların eşit bir şekilde temsil edilmesini sağlayan dört fareden oluşan bir alt kümeye odaklandı. (B) Bu görsel temsil, farelerin art arda iki gün boyunca %70 doğru seçimler elde ettikten sonra ilerlediği Y-Labirent görevinin aşamalarını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu çalışma, VR ortamlarında farelerin davranışsal tepkilerini araştırmak için cerrahi prosedürlerin uygulanmasına, sıvı kısıtlama protokollerine, sistem kurulumuna ve davranışsal görevlere odaklanan kapsamlı bir yaklaşım kullanmıştır. Bu bulgular, prosedürel ayrıntılar, eğitim için zaman çerçeveleri ve başarı oranları sağlayarak alana katkıda bulunur. Bu, farelerde VR prosedürlerinin daha etkili bir şekilde benimsenmesini sağlayacak ve araştırmalarında bu prosedürü kullanmakla ilgilenen laboratuvarlar için planlama ve uygulamayı kolaylaştıracaktır.

Kafa çubuklarının cerrahi implantasyonu, VR ortamlarında başa sabitlenmiş davranışsal deneyleri kolaylaştırmak için gerekliydi. Belirlenmiş protokolleri dikkatli bir şekilde takip ederek ve uygun ameliyat sonrası bakım sağlayarak, hayvanların sağlığı ve davranışları üzerindeki olumsuz etkileri en aza indirirken baş çubuklarının başarılı bir şekilde entegrasyonu sağlandı. Ek olarak, fareler arasında su alımını düzenlemek ve hidrasyon ve susuzluk seviyelerini korumak için sıvı kısıtlama protokolleri uygulandı. Kademeli alışma süreci ve suya periyodik erişim, davranışsal görevlerin yerine getirilmesini kolaylaştırırken hayvanların refahını sağlamak için çok önemliydi.

VR davranış sisteminin kurulumu, fareler için sürükleyici sanal ortamlar oluşturmak için donanım ve yazılım bileşenlerinin entegrasyonunu içeriyordu. Tamamen sürükleyici sanal ekranların, sıvı ödül sistemlerinin, küresel koşu bandı olarak strafor topların ve kafa tutucuların kullanılması, deneysel koşullar ve veri toplama üzerinde hassas kontrol sağladı. Doğrusal iz ve Y-labirent paradigmaları da dahil olmak üzere davranışsal görevler, fare davranışının hareket, karar verme ve ödül işleme gibi temel yönlerini araştırmak için dikkatlice tasarlanmıştır.

Deneysel prosedürleri optimize etmek için en iyi çabalara rağmen, çalışma sırasında çeşitli zorluklarla karşılaşıldı. Bireysel fare yanıtlarındaki değişkenlik ve donanım ve yazılım entegrasyonuyla ilgili teknik sorunlar, veri toplama ve analizinde zorluklar ortaya çıkardı. Ek olarak, sıvı kısıtlama protokollerine güvenmek, hayvanın hidrasyon durumunun dikkatli bir şekilde izlenmesini ve deneysel prosedürlerin buna göre ayarlanmasını gerektirdi. Bazen, fareler topun üzerine yerleştirildiğinde mücadele eder, ödül musluğundan içmezler veya donar ve topun üzerinde koşamazlar. Bu zorlukların bazıları geçici olsa da, ilerlemelerinde engellerle karşılaşmadıklarından emin olmak için fareleri izlemek çok önemlidir. Yaşıtlarına göre ilerleme gösteremeyen fareler çalışmadan çekilmelidir. Benzer bir deneyde, paradigma^25'i öğrenemedikleri için 55 fareden 4'ü çıkarıldı. Art arda 5 gün boyunca top üzerinde tutarlı hareketsizlik sergileyen fareler, ağırlıklarının, içmek için ödül musluğuna erişme yeteneklerinin ve altta yatan herhangi bir sorunun bulunmadığından emin olmak için topun üzerinde konumlandırmalarının kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesinin ardından çalışmadan çıkarıldı. Bu durumlarda, çalışmayı verimli bir şekilde sürdürmek için hangi stratejinin izleneceğine karar vermek araştırmacının takdirine bağlıdır.

Bu eğitim protokolleri, davranışsal görevleri yerine getirmedeki yeterliliklerini sağlarken farelere aşamalı olarak meydan okumak için tasarlanmıştır. Doğrusal parkurdan Y-labirent paradigmasına ilerleme kriterleri, farelerin ardışık başarılı denemeler ve ödül kazanımı gibi önceden belirlenmiş performans eşiklerini karşılama yeteneğine dayanıyordu. Sıkı eğitim protokollerinin uygulanması, farelerin davranışsal yeteneklerini ve giderek daha karmaşık görevlere uyum sağlama yeteneklerini değerlendirmemize izin verdi. Bu dikkatlice yapılandırılmış protokoller, davranışsal sinirbilim alanındaki araştırmacılar için sağlam bir çerçeve sağlar ve hayvanları çeşitli deneysel paradigmalar için değerlendirmek ve eğitmek için sistematik bir yaklaşım sunar. Araştırmacılar, ilerleme için net kriterlerin ana hatlarını çizerek, deneysel deneklerin öğrenme eğrisini verimli bir şekilde ölçebilir ve eğitim paradigmalarını buna göre düzenleyebilir. Ayrıca, bu metodolojik yaklaşım, deneyler arasında tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu teşvik eder, karşılaştırmalı analizleri kolaylaştırır ve hayvan modellerinde bilişsel süreçlerin ve öğrenme mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirir.

Fareler için bir VR paradigması tasarlarken, görev karmaşıklığı ve eğitim ilerlemesi ile ilgili mevcut yaklaşımları tanımak çok önemlidir. Bu protokol, deneysel bir tasarım oluşturmak için geniş bir çerçeve sunar, ancak ödül dağıtımı, yanlılık kontrolü, uyaran türü, görev ilerlemesi ve sistem parametreleri gibi belirli yönleri çalışmanın ihtiyaçlarına göre uyarlamak araştırmacıya bağlıdır. Örneğin, bazı çalışmalar, anında görev katılımına odaklanan daha akıcı bir yaklaşımı tercih ediyor. Bir örnek, farklı görevler arasında aşamalı bir öğrenme rejimi kullanmak yerine tek, tutarlı bir T-labirent görevi uygulayan Krumin ve ark. Buna karşılık, diğer çalışmalar, uyaran güçlendirme stratejileri ve işitsel ipuçları gibi çeşitli deneme tasarımı bileşenleri sunar. Çalışma, yanlış denemeler için bir ceza olarak işitsel geri bildirim kullandı ve doğru denemeler için ödül olarak sadece su sağladı²⁶. Tersine, Zhao ve ark. doğru denemeler için ödül olarak %10'luk bir sükroz çözeltisi kullandılar ve yanlış denemeler için herhangi bir ceza şekli içermediler²⁷. Bunun yerine, hayvanın önceki seçiminden işaret yönünü değiştirme olasılığını artırmayı ve motivasyonu artırmak için günlük su ödeneğini ayarlamayı içeren önyargı karşıtı eğitim gibi yöntemlerle yanlış tepkileri azaltmaya odaklandılar. Görev boyunca uzamsal ipuçlarının varlığı gibi deneysel tasarımdaki farklılıklar, Zhao ve ark. Harvey ve ark.'nın gözlemlediği seçime bağlı aktivasyon dizilerinin aksine, yörüngeler ve uzamsal tercihlerle açıklanan posterior parietal korteks hücre seçiciliğini bulmak^27,28. Kullanılan özel donanımın altı LCD monitör, uzatılabilir bir yalama musluğu ve hava yastıklı bir strafor top koşu bandı içerdiğini unutmamak önemlidir. Laboratuvarlar arasındaki sanal gerçeklik sistemleri arasında, projektörlerin²⁹ bilgisayar monitörlerine, küresel olmayan koşu bantlarının³⁰ ve sabit^10'a karşı uzatılabilir yalama ağızlarının kullanımı dahil olmak üzere bir dizi farklılık vardır.

Sonuç olarak, bu çalışma, VR ortamlarındaki farelerin davranışsal tepkileri hakkında değerli bilgiler sağlar ve karmaşık davranışları araştırmak için sürükleyici teknoloji kullanmanın fizibilitesini gösterir. Gelecekteki araştırma çabaları, deneysel protokollerin rafine edilmesine, karar verme süreçlerinin altında yatan nöral mekanizmaların araştırılmasına ve bulguların klinik uygulamalara çevrilmesine odaklanabilir. Bilim adamları, fare davranışının anlaşılmasını ilerletmeye devam ederek, hem sağlık hem de hastalıkta karmaşık davranışların altında yatan nöral devreleri ve bilişsel süreçleri daha da açıklayabilirler.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube