İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Özet

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

Özet

Embriyo implantasyonu, anne-embriyo arayüzündeki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerden etkilenir. Desidua içindeki çeşitli hücre tipleri arasındaki doğrudan ve dolaylı iletişim, endometriyal alıcılığı düzenlemek için çok önemlidir; Bununla birlikte, bu etkileşime aracılık eden moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. Bu bağlamda, endometriyal epitel-strom etkileşiminin biyolojisini özetleyebilecek kapsamlı bir in vitro model oluşturmak için implantasyon sürecini incelemek için bir modele ihtiyaç vardır. Bu model, normal hücre kültürü plakalarından ve düşük maliyetli malzemelerden üç boyutlu (3D) baskı ile oluşturulan eşleşen bir iskeleden oluşur. Burada, model oluşturma, hücre hazırlama, hücre tohumlama, hücre kültürü, gözlem ve değerlendirme için bir dizi protokolü detaylandırıyoruz. Ayrıca, mikroskop altında iyi büyüme koşulları sergileyen hücrelerle temsili sonuçları da dahil ettik. Bu çalışma, endometrial stromal hücreler ve epitel hücreleri arasındaki etkileşimin yanı sıra trofoblast hücreleri ile endometriyal hücreler arasındaki etkileşimi taklit edecek in vitro modeller geliştirmeyi amaçlamıştır.

Giriş

İnsan gebeliği ile ilgili kapsamlı araştırmalara rağmen, implantasyon ve erken gebelik sırasında maternal-fetal arayüzdeki moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır¹. İnsan endometriyumu esas olarak iki hücre tipinden oluşur: endometriyal epitel hücreleri (EEC'ler) ve endometriyal stromal hücreler (ESC'ler). İmplantasyon üç aşamada ilerler: yetkin bir embriyo ve alıcı endometriyum^2'nin gelişmesine yol açan atama, bağlanma ve istila. İnsan denekler üzerinde yapılan in vivo çalışmaların etik kısıtlamaları ve hayvanlarda insan durumunu tamamen simüle etmenin zorlukları göz önüne alındığında, in vitro insan endometrium kültür modellerinin oluşturulması, implantasyon ve erken gebelik süreçlerini çoğaltmanın etkili bir yolu haline gelmiştir³. Bu modeller hem normal hem de patolojik gebeliklerin araştırılmasında değerlidir ve translasyonel tıpta terapötik müdahalelerin ön testi ve doğrulanması için temel bir platform sağlar.

Ticari odalar, hücresel biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu odalar, hücre göçü ve farklı hücre türleri arasındaki karışma hakkında değerli bilgiler sunar. Bununla birlikte, ticari odalar tipik olarak tek kullanımlıktır ve maliyetli olabilir⁴.

İmplantasyonun ayrıntılı sürecini daha iyi anlamak için endometrium ve blastosist veya blastosist suretlerinden oluşan çok sayıda in vitro insan kültürü modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller, 3B yapının oldukça karmaşık bir deney düzeneği olması ve bazı spesifik farklılaşma ortamlarının pahalı olması nedeniyle hala ilk uygulama aşamasındadır ^5,6,7.

Uygun fiyatlı 3D baskı donanımının kullanılması ve nispeten kısa bir üretim süresi, yapıların farklı deneysel amaçları hedefleyecek şekilde yerleştirilmesini mümkün kılar. 3D baskı teknikleri, zaman maliyetlerini düşürmeye yardımcı olur ve karmaşık, özelleştirilmiş yapıların oluşturulmasını sağlar. Bu teknoloji, prototip tasarımını ve yinelemeyi önemli ölçüde hızlandırarak, onu çeşitli alanlardaki araştırmacılar için değerli bir araç haline getirerek çalışmalarını daha verimli bir şekilde tamamlamalarına olanak tanır ^8,9,10.

Burada, embriyo implantasyonu sırasında endometriyal alıcılığın araştırılması için endometriyal stromal ve epitel hücreleri arasındaki etkileşimi simüle edebilen 3D yapının inşası ve hücre kültürü sistemi olarak kullanımı için uygulanabilir ve ekonomik bir deneysel protokol sunuyoruz. Bu, ticari tek kullanımlık malzeme için özelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir alternatif sağlar.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda bulunabilir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'ye önceden dengelenmiştir.

İskele baskısı ve model yapımı 1. 3D

NOT: Buradaki adımlar, ticari 3D metal baskı makinesinin kılavuz kitabına göre gerçekleştirilmiştir. Adımlar aşağıda kısaca açıklanmıştır (Ek Dosya 1).

1. Baskı yatağı tesviye
   1. Kontrol panelindeki Menü simgesine dokunun ve Yardımcı Programlar'a gidin. Tesviye rutinini başlatmak için Yatak Seviyesi'ni seçin.
   2. Yazdırma sayfasını yazdırma yatağından çıkarın ve Bitti'yi seçin. Baskı yatağı, tesviye hazırlığı için maksimum yüksekliğine çıkacaktır. İlerleme çubuğu %100'e ulaştığında Başlat'a basın.
   3. Metal X yazıcı daha önce seviyelendirilmemişse, Sıfırla'yı seçin. Varsa, Atla'yı seçin ve doğrudan Adım 1.1.5'e (16 noktalı tarama) ilerleyin.
   4. Üç yataklı tesviye vidalarının tümünü sıkılaşana kadar saat yönünde çevirmek için 2.5 mm'lik bir altıgen anahtar kullanın. Ardından, orta nokta yüksekliğine ayarlamak için saat yönünün tersine iki tam tur çevirerek gevşetin. Devam etmek için Bitti'ye basın.
   5. Yazıcı, yatağı belirlenen 16 noktada tarar. Bu işlem sırasında yatağa veya çerçeveye dokunmaktan kaçının. İlerleme %100'e ulaştığında İleri'ye basın.
2. Yaprak yazdırma uygulaması
   1. Kalan metalleri veya destek kalıntılarını temizleyin. Vakum kaydırıcısını Açık konumuna getirin.
   2. Yatağın alçalmasına ve ısınmasına izin verin, ardından İleri'ye basın. Yazdırma sayfasını vakum ızgarasının üzerine yerleştirin ve İleri'ye basın.
   3. Yaprak baskı makinesini, haznenin arkasındaki Z raylarıyla hizalayarak baskı kağıdının üzerine yerleştirin.
   4. Vakumun yerine oturmasını ve sabit bir sızdırmazlık oluşturmasını bekleyin. Vakum devreye girdiğinde, Bitti'ye basın.
3. Metal filament yükleme
   1. Yazıcı kafasını manuel olarak yazdırma alanının ortasına yerleştirin. Yazıcı kafası kapağını yukarı kaydırarak ve montaj vidalarından çıkararak çıkarın.
   2. Seçenek panosundaki Menü simgesine dokunun. Seçeneklerden Malzemeler'i seçin.
   3. Yükleme yordamını başlatmak için Metal Yükle'yi seçin. Hızlı Yükle'yi seçin.
   4. Yüklenecek özel metal malzeme türünü seçin (örneğin, Alüminyum 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Makarayı tutucuya yerleştirin ve İleri'ye basın. Kapıyı kapatın ve makaraların ısınmasına izin verin, ardından İleri'ye basın.
   6. Malzemeyi, ekstrüder çekmeye başlayana kadar yazıcı kafasının ön girişine (M etiketli) yerleştirin.
4. Metal parça baskısı
   1. Yazdırma Ayarları panelinde, Kağıdı Dışa Aktard'yi tıklatın. Dosyayı FAT32 olarak biçimlendirilmiş bir USB sürücüsüne kaydedin ve yazıcıya takın.
   2. Panodaki Menü simgesini seçin. Depolama Alanı'na gidin ve Depolama Alanından Yazdır'ı seçin. Yazdırmaya başlamak için parça dosyasını seçin.
5. Metal parça çıkarma
   1. Yazdırma sayfasını ve yazdırılan parçaları baskı yatağından dikkatlice kaydırın. Parçaları baskı sayfasından yavaşça ayırın. Esnek tabaka kolaylıkla soyulmalıdır.

2. 3D modelde hücre ko-kültürü için hazırlık

NOT: Hücre kültürü deneylerinde her kullanımdan önce otoklav sterilizasyonunu kolaylaştırmak için 3D baskı hücre lamel iskele destekleri için sarf malzemesi olarak yüksek sıcaklığa dayanıklı malzemelerin kullanılması önerilir. Bu çalışmada ölümsüzleştirilmiş İnsan Endometriyal Stromal Hücreleri (HESC) ve insan endometriyal epitel hücreleri (Ishikawa) kullanıldı. Bu hücre hatlarının karakterizasyonu daha önce bildirilmiştir ^5,6.

1. Hücre kültürü ve pasajı
   1. DMEM / F12 ortamı + 2 mM L-Glutamin +% 10 kömürle sıyrılmış Fetal Sığır Serumu (FBS) +% 1 Penisilin / Streptomisin Çözeltisi ekleyerek hESC için 50 mL tamamlayıcı ortam hazırlayın.
   2. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium +% 10 FBS +% 1 Penisilin / Streptomisin Çözeltisi ekleyerek Ishikawa için 50 mL tamamlayıcı ortam hazırlayın.
   3. Hücre çözülmesi
      NOT: Satın alınan hücre hattı, donmuş halde kuru buz üzerinde sevk edilmiştir. Sıvı nitrojenin buhar fazında veya -130 °C'nin altında saklanmalıdır.
      1. Gerekli tüm sterilize edilmiş ekipmanı ve ayrışma enzimini hazırlayın ve tamamlayıcı ortamı 37 °C'ye ısıtın.
      2. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda ara sıra hafifçe sallanarak hızla çözün. Hücre süspansiyonunu 5 mL bazal kültür ortamı içeren bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücre peletini 5 mL hazırlanmış tam kültür ortamında yeniden süspanse edin ve iki T25 kültür şişesine dağıtın. Hücreleri bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO_2'de kültürleyin.
2. Bir lamel ile hücrelerin hazırlanması
   1. Hücre kültürünün yüzeyi olarak 18 mm'lik kare bir lamel kullanın; Lamelin temiz ve steril olduğundan emin olun.
   2. Lameli 12 oyuklu bir plakanın dibine 200-300 μg/mL konsantrasyonda 200 μL hücre dışı matris (ECM) ile kaplayın. Plakayı 1 saat boyunca 37 °C'de tutun.
   3. ECM'yi plakadan çıkarın. Hücreleri uygun birleşme açısından inceleyin ve her iki hücre hattının yoğunluğunun %70-80 civarında olduğundan emin olun
   4. Harcanan ortamı çıkarın ve hücreleri 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) 2x ile yıkayın.
   5. 2 mL ayrışma enzimi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 2 dakika kültürleyin.
   6. Tam kültür ortamı ile nötralize edin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.
   7. 100 μL hücre süspansiyonu alın ve tripan mavisi (seyreltme faktörü = 2) ile karıştırın.
   8. Lameli hemositometrenin haznesinin üzerine kaydırın. Her iki yan bölmeyi tripan mavisi içeren hücre süspansiyonu ile doldurun.
   9. 20x mikroskop altında her iki taraftaki karelerdeki hücre sayısını sayın ve hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.
   10. Hücreleri taze besiyeri ile hazırlanan plakaya aktarın ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin. hESC'yi 24 saat boyunca 1 x 10⁵ hücre / mL'de kuyuya tohumlayın.
   11. Ishikawa hücre hattı için, ertesi gün hücreyi lamel olmadan kuyuya tohumlayın.

3. Ko-kültür modelinin montajı

1. İskeleleri etil alkol ve çift damıtılmış su (ddw) ile 2 gün boyunca iyice ıslatın. İskeleleri otoklav ile 121 °C'de sterilize edin ve kurutun.
2. Ishikawa hücre hattı için iyi kültür yapan Ishikawa'ya yaklaşık 2 mL tamamlayıcı ortam ekleyin ve sıvı seviyesinin lamel kaplamasını sağladığından emin olun.
3. hESC ile lamel kapağını iskeleye aktarın ve hücrenin aşağı baktığı tarafı aşağıda tutun. İskeleyi iyi işleyen Ishikawa'ya takın. İkinci set için, lamel kapağını Ishikawa ile iskeleye aktararak ve iskeleyi iyi işleyen hESC'ye takarak bu düzenlemeyi ters çevirin. Bağımsız olarak büyüyen hücre büyümesi analizi için hücreleri iskele kurulumu olmadan kullanın.
4. Ko-kültür sistemini 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. Ko-kültür periyodu, deneysel tasarıma bağlı olarak değişebilir, ancak tipik olarak 24-72 saat arasında değişir.

4. Görüntü edinme

1. Kültür ortamını dikkatlice çıkarın ve hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe durulayın.
2. İnce forseps veya cımbız kullanarak kültür kaplarından ekli hücrelere sahip lamelleri çıkarın. İsteğe bağlı olarak, transfer sırasında kurumasını önlemek için lamelleri PBS ile yeni bir kaba yerleştirin.
3. Temiz bir mikroskop lamı alın ve bir damla PBS yerleştirin. Lameli içeren hücreleri yavaşça montaj ortamının üzerine aktarın ve hücrelerin slayta bakacak şekilde olduğundan emin olun.
4. Hazırlanan slaytı ters çevrilmiş mikroskobun tablasına yerleştirin. Uygun objektif lensi (örn. 10x, 20x) seçin ve kaba ve ince odak düğmelerini kullanarak odağı ayarlayın.
5. Aydınlatma yoğunluğu ve kamera ayarları gibi mikroskop parametrelerini ayarlayın. Mikroskop yazılımını kullanarak, hücrelerin istenen büyütme ve görüş alanlarındaki görüntülerini yakalayın. Görüntü kalitesini optimize etmek için pozlama süresini ve diğer görüntüleme ayarlarını yapın.

5. Görüntü işleme

1. Görüntüyü açmak için Aç'a tıklayın, Yerel Eşitlemeyi Seç'> İşlem'> Filtreler > Geliştirme'ye tıklayın ve Uygula'ya tıklayın.
2. Düzenle > Gri Tonlamaya Dönüştür 8'> tıklayın. Geliştir'i tıklayın, Kontrast Uygula'yı seçin.
3. Konuları sayma ve ölçme'ye tıklayın. Manuel'i tıklatın, bir aralık seçin ve tüm hücrelerin kapsandığından emin olmak için histogramı ayarlayın.
4. Maskeyi Uygula'ya tıklayın, geçerli pencereyi kapatın, Ölç'> Otomatik Parlak Nesneler'e tıklayın, Ölçüm'ü seçin ve Aera, Dendric, Yoğunluk ve Boyut'u seçin.
5. Otomatik Parlak Nesneler'i tıklayın, sonra Sayım'ı tıklayın. Ölçüm verilerini bir e-tabloya aktarmak için Verileri Dışa Aktar'a tıklayın.

6. Hücre toplama

1. Lamelleri mikroskop lamından çıkarın ve temiz ve kuru bir kuyuya aktarın.
2. Ishikawa hücresini transkriptomik için RNA izolasyon reaktifi veya proteomik araştırma için Ripa lizis reaktifi ile hasat edin.
   NOT: ESC için, lamel kültürü yöntemi, immün boyamadan sonra görüntü yakalama için daha etkiliydi. Alternatif olarak, hESC, RNA izolasyon reaktifi veya Ripa lizis reaktifi ile hasat edilebilir. Lamel veya plakanın yüzeyi üzerinde kültürlenen hücre hatları değiştirilebilir; Bununla birlikte, görüntüleme analizi için hazırlanan hücrelerin lamel üzerine tohumlanmasını öneririz.

Sonuçlar

Şekil 1, dört L şeklinde çubuk benzeri yapıya sahip bir bazal hücre sürgü tutucusu ile tamamlanan, standart 12 oyuklu hücre kültürü plakalarına bağlanmak üzere uyarlanmış bir üst destek halkası içeren, bu işlemde kullanılan hücre kızakları için ev yapımı iskeleyi göstermektedir.

Şekil 2'ye göre, ko-kültür koşulundaki her iki hücre tipinin yoğunluğu (

Tartışmalar

Endometriyal, stromal ve epitel hücrelerinin dolaylı ko-kültürü için basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir protokol tanımlanmıştır. Bu yöntem, dört L şeklinde çubuk benzeri yapıya sahip bir bazal hücre sürgü tutucusu ile tamamlanan, standart 12 oyuklu hücre kültürü plakalarına bağlanmak üzere uyarlanmış bir üst destek halkası içeren hücre kızakları için ev yapımı bir iskele kullanır. Bu kurulum, endometriyal stromal ve epitel hücrelerinin ayrılm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme