Glioblastomun Lazer İnterstisyel Termal Tedavisi için İmmünkompetan Bir Murin Modeli

Özet

Glioblastom, primer beyin kanserinin yıkıcı bir şeklidir ve lazer interstisyel termal terapi, ameliyat edilemeyen glioblastom için geleneksel cerrahi rezeksiyona umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tedavi etkilerini veya adjuvan ve kombinatoryal tedavileri incelemek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir klinik öncesi fare modelini tanımlar.

Özet

Primer beyin kanserinin en agresif formu olan glioblastoma (GB), yetişkinlerdeki tüm yüksek dereceli primer beyin tümörlerinin yaklaşık yarısını oluşturur ve tedavisi yoktur. Lazer interstisyel termal tedavi (LITT), GB için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı bir tedavidir ve konvansiyonel cerrahi rezeksiyon için aday olmayan hastalarda kullanılır. LITT'nin klinik etkinliği belirlenmiş olsa da, klinik vaka çalışmaları ve vaka serilerinin ötesindeki araştırmalar sınırlıdır ve yerleşik bir hayvan modelinin olmaması nedeniyle engellenmektedir. Bu protokol, insan GB'sini yakından özetlemek için C57BL / 6 fareleri ve sinjeneik CT2A glioma kanser hücre hattını kullanır ve aynı zamanda 1064 nm Neodimyum katkılı İtriyum Alüminyum Garnet (Nd: YAG) lazer, örneğin iki FDA onaylı LITT sisteminden birinde kullanılır ve mükemmel klinik öncesi alaka düzeyi sağlar. Bu LITT fare modelinin başarılı bir şekilde kurulması, LITT ablasyonunun benzersiz özelliklerini ve tümör mikroçevresi üzerindeki etkilerini araştırmak için değerli bir platform sağlayacak ve potansiyel olarak gelişmiş terapötik stratejilere yol açacaktır.

Giriş

Kanser, Kanada'da bir numaralı önde gelen ölüm nedenidir. Agresif beyin tümörünün en yaygın formu olan glioblastoma (GB), yetişkinlerde tüm yüksek dereceli primer beyin tümörlerinin %48 ila %60'ını oluşturur¹. GB için prognoz, cerrahi rezeksiyon, kemo- ve radyoterapi^dahil olmak üzere geleneksel tedavilerle 5 yıllık net sağkalım% 4.8 ile özellikle acımasızdır ^1,2.

Lazer İnterstisyel Termal Terapi (LITT), ameliyat edilemeyen beyin tümörleri olan hastalarda hipertermik in-situ tümör ablasyonu için lazer kullanan FDA onaylı bir prosedürdür ve geleneksel cerrahi rezeksiyon^3'e çekici bir terapötik alternatif sağlar. Bununla birlikte, GB'nin LITT tedavisi için ayrıntılı ve iyi karakterize edilmiş bir fare modeli eksiktir ve bu da klinik öncesi araştırmaları engellemektedir.

Bu protokol, LITT ile GB tedavisi için optimize edilmiş bir klinik öncesi fare modelini sergilemeyi amaçlamaktadır. Bu model için C57BL / 6 farelerini ve sinjeneik glioma hücre hattı CT2A'yı kullanmayı seçtik, çünkü CT2A, benzer histolojik özelliklere, invazivliğe, kemo- ve radyo-rezistansa ve kök benzeri özelliklere sahip insan yüksek dereceli GB'yi yakından özetler ve kendini yenileme ve tümörlerin yeniden kurulması ile^4. Bu özellikler, bağışıklık tepkilerini veya yeni terapötik stratejileri içeren çeşitli çalışmalar için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, bu LITT protokolünün teknik yönleri, daha fazla tartışılacak olan diğer allo- ve ksenogreft murin modelleri ^4,5,6 için de kolayca uyarlanabilir.

Bu protokolün avantajları, basit ama etkili bir LITT tedavi paradigması ile tutarlı sonuçlar içerir. Kullanılan 1064 nm Neodimyum katkılı İtriyum Alüminyum Garnet (Nd: YAG) lazer, şu anda FDA onaylı iki sistemden birinde klinik olarak kullanılanla aynıdır ve yüksek dereceli glioma tedavisi için LITT'nin klinik uygulamasına yakından paralel deneylere izin verir. Bu protokolün birincil dezavantajı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hem tümör hücresi implantasyonu hem de LITT tedavisi sırasında alınması gereken aşırı özendir. Ek olarak, CT2A hücre hattının agresif doğası nedeniyle, protokol zamana oldukça duyarlıdır. Çoğu deneyin en fazla 20 gün içinde sonuçlandırılması gerekecektir, bu da bazı adaptif bağışıklık tepkilerinin veya daha uzun bir süre boyunca meydana gelen diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların araştırılmasını sınırlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol için hayvan etiği, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) tarafından belirlenen etik yönergelere uygun olarak Manitoba Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, histolojik analiz, immünolojik değişiklikler veya kombinatoryal terapötik müdahalelere odaklanan deneyler dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesine sahip klinik öncesi bir model için 8-12 haftalık C57BL / 6 immünokompetan fareler ve sinjeneik glioma hücre hattı CT2A kullandı. Protokol, deneysel gereksinimlere bağlı olarak diğer fare türlerine veya hücre hatlarına kolayca uyarlanabilir.

Şekil 1: Temel deney tasarımının grafik şeması. Şununla oluşturuldu BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kısaca hücre hazırlığı (Gün 0)

1. Hücre kültürüne başlamadan önce, kabinin ve gerekli tüm pipetlerin UV ve etanol ile tamamen sterilize edildiğinden emin olun.
2. DMEM / F12'yi bir su banyosu kullanarak% 10 FBS ortamı, fosfat tamponlu salin (PBS) ve tripsin ile oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
3. Ortamı T25 şişesinden pipetleyin ve hücreleri PBS ile kısa bir süre durulayın. Hücrelere 1 mL tripsin ekleyin ve hücreler şişeden ayrılana kadar 30-60 s inkübe edin.
4. Ayrılan hücreleri bir ışık mikroskobu altında onaylayın ve tripsin enzimatik aktivitesini durdurmak için 4 mL ortam ekleyin.
5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   1. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın, ardından hücre sayma slaydına 10 μL ekleyin.
   2. Slaytı hücre sayma makinesine yerleştirin ve toplam hücre sayısını, canlı hücre sayısını ve canlı hücrelerin yüzdesini kaydedin.

NOT: Otomatik bir hücre sayma makinesi mevcut değilse, bir hemositometre kullanılarak manuel sayım yapılabilir.

6. Planlanan tüm enjeksiyonlar için gerekli hücreleri hesaplayın.
   NOT: CT2A için, enjekte edilen hacimde 1.5 μL başına 5000 hücre ve her preparat için minimum 100 μL toplam hacim önerilir.
7. Hücreleri pelet yapmak ve mümkün olduğunca fazla ortamı aspire etmek için hücreleri 5 dakika boyunca 134 x g'da döndürün.
8. Bir mikrosantrifüj tüpünde ihtiyaç duyulan hacim için PBS'de %5 bazal membran özütü ile hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için daha küçük tüpler en uygun olsa da, hücrelerin daha yuvarlak tabana topaklanma ve hafif bir fiske ile kolayca yeniden dağılma olasılığı daha düşük olduğundan, 2 mL'lik bir tüp ameliyat sırasında depolama için daha iyidir.
9. Hücreleri enjeksiyon için buz üzerinde tutun, gerektiğinde her 4-5 saatte bir taze hücre süspansiyonları hazırlayın.

2. Ortotopik implantasyon (Gün 0)

1. Cerrahi alanı hazırlayın ve gerekli tüm aletlerin steril ve kullanıma hazır olduğundan emin olun.
2. Solunum hızını izlerken (hedef 60 bpm) bir odada izofluran (1 L / dak O_2'de %3 buharlaştırılmış) kullanarak fareyi uyuşturun.
3. İlaç dozu için hayvan ağırlığını elde edin ve kaydedin.
4. Gözleri, kulakları ve bıyıkları önlemek için cerrahi bölgeyi dikkatlice tıraş edin.
5. Hayvanı stereotaktik bir çerçeveye aktarın.
   1. Kesici dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin ve sabitlemek için tutma vidasını sıkarak nosekonu tam oturana kadar ayarlayın.
   2. Anestezi derinliğini iki taraflı arka bacak ayak parmaklarıyla kontrol edin ve uygunsa kafatasını kulak iğneleri kullanarak sabitleyin ve hayvanın kafasını nötr, düz düzlem pozisyonuna ayarlayın.
   3. Yağlanmış bir rektal sıcaklık probu kullanarak hayvan çekirdek sıcaklıklarını izleyin ve bir vücut altı ısıtma yastığı kullanarak 37 ° C'de ek ısıtma sağlayın.
      DİKKAT: Burun kemiği üzerindeki hafif basınç bile solunum durmasına neden olabileceğinden, burun konisini aşırı sıkmamaya dikkat edin. Elektrikli bir ısıtma yastığı kullanılıyorsa (örneğin, bir teraryum için bir ısıtma yastığı), sıcaklık ayarlarının doğru olduğundan ve ayarlanan sıcaklığın sabit kaldığından emin olun.
6. Kurumayı önlemek için her iki göze de bolca oftalmik merhem sürün.
7. Profilaktik enjeksiyonları uygulayın ve anestezik derinliği kontrol edin.
   1. 28 G x 1/2 "şırınga kullanarak yerel hayvan tesisi yönergelerine göre (örneğin, 5.0 mg / kg meloksikam) deri altı (sc) meloksikam veya diğer uzun etkili ağrı kesici ilaçları enjekte edin.
   2. Daha uzun prosedürler sırasında profilaktik sıvı desteği için 20 mg / kg sc önceden ısıtılmış normal salin enjeksiyonu uygulayın.
   3. Hedef solunum hızını korumak için anestezik% 1.5 -% 2.0 izoflurana düşürün.
8. Aseptik bir teknik kullanarak hayvanı örtün ve cerrahi alanı hazırlayın.
   1. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak povidon-iyot veya klorheksidin dezenfekte edici solüsyon uygulayın. Kesi bölgesinde medial olarak başlayarak ve her geçişten sonra swabı döndürerek dışa doğru çalışın, ardından taze steril bir pamuklu çubuk kullanarak bölgeye benzer şekilde% 70 etanol uygulayın.
   2. İyot ve ardından %70 etanol ile fırçalamayı iki kez daha tekrarlayın (her biri toplam 3 kez).
9. Cerrahi maruziyete devam etmeden önce anestezik derinliği tekrar kontrol edin. İşlem boyunca solunum hızını yakından izleyin ve anesteziyi gerektiği gibi ayarlayın.
10. Orta hattan başlayarak ve gözlerin biraz arkasında, #15 bıçaklı bir neşter kullanarak kaudal yönde 1-1,5 cm'lik bir orta sagital kesi yapın. Alternatif olarak, iris makası ile kısa bir neşter kesisi uzatın.
    NOT: İnsizyonlar orta hatta başlamalıdır, ancak tek taraflı enjeksiyonlar için, Bregma ve çapak deliği konumunun eşzamanlı görselleştirmesini ve erişimini kolaylaştırmak için hafifçe yanal olarak açılı olabilir.
11. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kafatasını görselleştirmek için yara kenarlarını yansıtın ve bölgedeki bağ dokusunu nazikçe ovalayın.
    1. Gerekirse, kafatası yüzeyini temizlemek ve kraniyal dikişleri görselleştirmek için hidrojen peroksite batırılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
12. Sol ve sağ koronal sütürlerin sagital sütür ile orta hatta birleştiği yerde Bregma'yı bulun (bkz. Şekil 2).
    1. Toksik olmayan renkli bir akrilik reçine ve steril bir tahta kürdan veya benzeri bir şey kullanarak Bregma üzerinde çok küçük bir işaret bırakın.
       NOT: Bazı durumlarda, sol ve sağ koronal sütürler birbirini yansıtmaz; Bu gibi durumlarda, orta sagital düzlem boyunca nerede kesişmeleri gerektiğini yaklaşık olarak belirlemek için bir 'en uygun çizgi' kullanın.
13. Hayvanın baş pozisyonunun eğilmediğinden veya döndürülmediğinden emin olun (yani düz bir düzlemde).
    1. Bregma'da sıfır stereotaktik koordinatlar. X koordinatı, medial-lateral (ML) düzlemdeki hareketi, ön-arka (AP) düzlemdeki y koordinatını ve dorsal-ventral (DV) düzlemdeki z koordinatını ifade eder.
    2. Lambda'nın Bregma ile aynı DV düzleminde olduğundan emin olun (yani, her iki yer işaretinde de z = 0). Benzer şekilde, Bregma'nın yanlarında +2.0 mm (x = 2) ve -2.0 mm'de (x = -2.0), kafatasının aynı düzlemde olduğundan ve DV / z koordinatının kabaca eşit olduğundan emin olun. Kafatasının sağlam olduğundan ve herhangi bir ayarlamadan sonra hareket etmediğinden emin olun.
14. Bregma'dan +2.0 mm (ML) ve +0.5 mm (AP) çapak deliği açın (Şekil 3).
    1. Stereotaktik bir matkap ataşmanı kullanarak, ucun ucunu Bregma ile temas edene kadar dikkatlice indirin ve koordinatları sıfırlayın.
    2. Ucu hafifçe kaldırın ve matkabı uygun AP ve ML koordinatlarına ayarlayın.
    3. Matkabı yavaşça indirin, sadece kafatasından çapak almamaya dikkat edin.
    4. Alternatif olarak, stereotaktik çerçevede mikrolitrelik bir şırınga kullanarak, iğne ucunu Bregma ile temas edene kadar indirin ve koordinatları sıfırlayın.
    5. İğneyi hafifçe kaldırın ve uygun AP ve ML koordinatlarına ayarlayın.
    6. Ucu kafatasına değene kadar indirin ve tam yerini not edin.
    7. İğneyi hafifçe kaldırın ve cerrahi bir işaretleyici ile hedef yerde küçük bir işaret yapın.
    8. İğne taşıyıcıyı yoldan kaldırın veya döndürün ve bir el matkabı kullanarak kafatasına çapak alın, altındaki beyne zarar vermemeye dikkat edin. DİKKAT: Genel olarak, yaşlı erkek fareler nispeten daha kalın kafataslarına sahiptir ve daha kapsamlı delme gerektirir. Kafatasındaki ani kırılmalar altta yatan meninkslere ve/veya beyne zarar vereceğinden, elle delme işlemi dikkatli bir şekilde yapılmalı, minimum basınç uygulanmalıdır.
       NOT: LITT prosedürü sırasında termokupl probunu yerleştirmek için çapak deliğinin bir uzantısı gereklidir. Bu, ilk enjeksiyon ameliyatı sırasında daha kolay yapılabilir ve daha hızlı ve daha akıcı bir LITT ameliyatını kolaylaştırır. Alternatif olarak, LITT ameliyatı sırasında çapak deliği aynı şekilde uzatılabilir, bu da ekstrakraniyal tümör büyümesi riskini azaltabilir.
15. Termokupl için +3.0 mm ML ve +0.5 mm AP'de (enjeksiyon bölgesinin 1.0 mm yanal) ikinci bir çapak deliği oluşturun.
    1. Önceki adımda belirtildiği gibi delme prosedürünü izleyin.
    2. Kemik büyümesi ile ilgili zorlukları önlemek için, iki delik arasındaki kemiği çıkarın.
       NOT: Tümör implantasyonu için koordinat olarak Bregma'dan +2.0 mm ML, +0.5 mm AP ve -2.5 mm DV kullanılması önerilir. Üst striatumdaki bu konum, hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tutarlı tümör büyümesi sağlar - ancak protokol diğer yerlere uyarlanabilir.
16. CT2A fare glioma hücre süspansiyonunu mikrolitre şırıngada (1.5 μL'de 5000 hücre) hazırlayın.
    1. Önceden hazırlanmış mikrosantrifüj hücre tüpünü buzdan çıkarın ve yeniden askıya almak için parmak ucunuzla hafifçe vurun.
    2. Kabarcıkları önlemek için 5 μL veya 10 μL'lik bir şırıngaya 2 μL'yi nazikçe çekin.
    3. Havayı çıkarmak ve iğnenin astarlandığından ve doğru çalıştığından emin olmak için 0,5 μL'yi eksprese edin.
    4. Eksprese edilen sıvıyı ve dış yüzeydeki hücreleri (leptomeningeal tümör büyümesine neden olabilir) çıkarmak için iğne milini alkollü bir çubukla silin.
17. Şırıngayı bir mikroenjektör şırınga pompasına (veya manuel stereotaktik eke) yükleyin ve iğneyi yavaşça indirin.
    1. İğneyi yavaşça derinliğe (z = -3.0 mm) indirin ve 1 dakika bekleyin.
    2. İğneyi yavaşça 0,5 mm (z = -2,50 mm) geri çekin ve hücreleri enjekte edin (≤ 0,5 μL/dak). İğneyi bozmamaya dikkat ederek mikrocerrahi sünger mızrak kullanarak şırınganın etrafındaki alanı kuru tutun.
    3. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra en az 2 dakika bekleyin, ardından şırıngayı 3-4 dakikalık bir süre boyunca yavaşça geri çekin. Hücrelerin orijinal enjeksiyon bölgelerinden çıkmasını önlemek için ilk 4-5 geri çekme aralığının geri çekme başına 100 μm olduğundan emin olun.
    4. Alkollü bir bez kullanarak, iğnenin dışını nazikçe silin ve herhangi bir kan veya sıvıdan arındırın ve şırıngayı üreticinin yönergelerine göre yıkayın ve temizleyin. İğnenin tıkanmadığından emin olmak için enjeksiyonlar arasında PBS ve damıtılmış su kullanın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, iğneden kalan hücreleri çıkarmak için iğneyi %70 etanol ile cömertçe yıkayın.
       DİKKAT: Her enjeksiyondan sonra iğneyi yıkamamak tıkanıklığa neden olabilir. Birden fazla hücre tipine enjekte ediliyorsa, olası çapraz kontaminasyonu önlemek için her tip için ayrı bir iğne kullanın.
18. Altta yatan dermisin temas etmesi için yara kenarlarını hafifçe kesmeye dikkat ederek insizyonu yeniden yaklaştırın. Yarayı bir yara klipsi veya 5-0 dikişle 3 kesikli dikiş kullanarak kapatın. Kapalı yaraya povidon-iyot çözeltisi uygulayın.
19. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedi üzerine kağıt kaplı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Kafes tabanında bulunan küçük bir tabak ıslak yemek ile hayvanı ev kafesine geri transfer etmeden önce sternal yaslanmanın sağlandığından emin olun.
20. Hayvanı, ameliyat gününden başlayarak sonraki 2 gün boyunca günde en az iki kez izleyin. Meloksikamı 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra veya kurum yönergelerine göre okuyun.

Şekil 2: Bir fare kafatasının ve stereotaktik cerrahi için önemli anatomik işaretlerin grafiksel gösterimi. Şununla oluşturuldu BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çapak deliklerinin ve lazer cihazlarının konumlarını gösteren grafiksel çizim. Bregma yer işaretinin göreceli konumlarını, (A) (A') lazer fiberi için ilk çapak deliğini ve (B) (B') termokupl probu için ikinci veya uzatılmış çapak deliğini gösteren çizim. Lazer fiber ve termokupl problarının kesik bir tasviri sağda gösterilmiştir, bu da probların istenen boyut ve aralıkta önceden delinmiş deliklerle stereotaktik bir uç ayak içinde nasıl stabilize edildiğini göstermektedir. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. LITT öncesi tümör yükünün izlenmesi (9. Gün)

1. LITT'den önceki gün tümör büyümesini değerlendirmek için kurumsal yönergeleri izleyerek T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gerçekleştirin.
   NOT: Tümörlerin çapı ~ 1.5-2.0 mm olmalıdır.
   1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak tüm fare beyninin uygun bir koronal taramasını elde edin: hızlı dönüş yankı dizisi, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, yankı trenleri = 7, FOV = 30 x 30 mm², matris boyutu = 250 x 256, toplam dilimler = 18, dilim kalınlığı = 0,3 mm, ortalamalar = 2.
      NOT: Ayrıca, başarılı allogreftlemeyi doğrulamak ve özellikle ilk deneyler sırasında tümör büyümesini izlemek için implantasyondan yaklaşık 6. günden başlayarak periyodik MRG yapılması önerilir, çünkü prosedürdeki ince değişiklikler bile zaman çizelgesini değiştirebilir. CT2A oldukça agresiftir ve hayvanların yakından izlenmesi gerekir. T2 ağırlıklı bir koronal tarama bu amaç için iyi çalışır. Floresan etiketli veya lusiferin etiketli CT2A hücrelerinin in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) ile birlikte kullanılması, küçük bir hayvan MRG'sine erişimin olmadığı durumlarda da uygun olabilir. Bununla birlikte, büyüme kinetiği ve diğer tümör özellikleri bu protokolden farklı olacaktır.

4. LITT ameliyatı (10. gün)

1. Yukarıdaki bölüm 2'de olduğu gibi, hayvanı LITT'ye hazırlamak için 2.1-2.13 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Önceki ameliyattan kaynaklanan yara iyileşmesi, deneysel zaman çizelgesindeki türlere ve varyasyonlara bağlı olarak farklı aşamalarda olabilir. İnsizyonu yeniden yaparken daha ince veya daha hassas dokuya dikkat edin.
2. Steril pamuk uçlu bir bez kullanarak kafatasını nazikçe temizleyin, Bregma'yı veya önceden yapılmış çapak deliğini gizleyen dokuları temizleyin. Gerekirse, çapak deliğini yeniden delin, ancak CT2A tümör oluşumunun hızı nedeniyle, herhangi bir kemik büyümesi bekleniyorsa çok azdır.
3. LITT eki stereotaktik çerçevede yerindeyken, lazer fiberinin ucu için Bregma'daki koordinatları sıfırlayın.
   DİKKAT: Lazer fiberi çok kırılgandır ve bükülürse çatlar. Lazer fiberin ucu kafatasına temas ettiği anda durmaya dikkat edin.
4. Ucu hafifçe kaldırın ve istenen ML ve AP koordinatlarına hareket edin, ardından hedefe ulaşmak için probları yavaşça hedef DV koordinatına indirin (2,0 mm ML, 0,5 mm AP, -2,0 mm DV).
5. LITT tedavi parametrelerini ayarlayın: Mod: sürekli; Güç: 1 W
6. Lazeri Bekleme modundan Aktif duruma getirin ve ayak pedalını kullanarak lazeri 60 saniye boyunca devreye alın. Sıcaklık 46 °C'nin üzerine çıkarsa, kısa bir süre duraklayın, ardından sıcaklığı mümkün olduğunca 46 °C'ye yakın tutmaya çalışarak yeniden devreye girin.
7. Lazer aksamını yavaşça geri çekin ve lazer fiberini ve termokupl'u alkollü bir bezle nazikçe silerek temizleyin. Probların çerçeveye temas etmemesine dikkat ederek düzeneği yoldan döndürün.
8. Yarayı kapatın ve yukarıdaki tümör implantasyonunu takiben 2.18-2.20 adımlarında anlatıldığı gibi hayvanı kurtarın.

5. LITT sonrası değerlendirme (11. gün)

1. Yukarıdaki adım 3.1'deki sıra ve parametreleri kullanarak başarılı LITT tümör ablasyonunu değerlendirmek için LITT tedavisinden sonraki gün LITT sonrası T2 ağırlıklı MRG gerçekleştirin.
   NOT: Ek olarak, sıvı ile zayıflatılmış bir inversiyon kurtarma (FLAIR) dizisi de ameliyat sonrası ödemin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir.
2. Tedavi sonrası değişiklikleri veya tümörün yeniden büyümesini izlemek için çalışma bitiminden önce takip taramaları yapın.

6. Öğrenim sonu (Gün 11 / Gün 15 / Gün 20)

1. Kurumun yönergelerine göre seçilen deneysel uç noktalarda hayvanları ötenazi yapın.
   NOT: 20. günden sonraki uç noktalar, son derece düşük hücre sayılı aşılamalarda bile CT2A ile mümkün değildir, çünkü kontrol hayvanları (yani, sahte cerrahi veya tedavi yok) ve bazı tedavi grubu hayvanları can çekişiyor olabilir ve ötenazi gerektirebilir. Daha uzun deneyler için alternatif fare glioma hücre modellerini düşünün.
2. Fiksasyon ve işleme için dokuları toplayın.
   1. % 4 paraformaldehit (PFA) ile kardiyak perfüzyon yapın ve ilgilenilen dokuları toplayın.
   2. Beyin dokusunu gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'ya daldırarak düzeltin.
   3. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) veya sabit-donmuş analiz için standart uygulamaları kullanarak numuneleri işleyin.

7. Analiz

1. T2 ağırlıklı MRI kullanarak başarılı LITT ablasyonunu doğrulayın ve hematoksilen ve eozin boyası gibi temel histolojik teknikleri kullanarak doğrulayın.
2. Deneyler için gerekli ek analizleri yapın (ör., immünohistokimya, immünofloresan).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Başarılı CT2A tümör implantasyonu ve LITT tedavileri, Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterildiği gibi T2 ağırlıklı MRG kullanılarak karakterize edilebilir. MR görüntüleri, yukarıdaki protokolde belirtilen dizi parametreleri kullanılarak 17 cm delikli ve dörtlü fare kafası bobinine sahip 7T kriyojen içermeyen süper iletken bir mıknatıs kullanılarak elde e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

LITT ile ilgili hızla genişleyen bir literatür bulunmaktadır; Bununla birlikte, öncelikle insan klinik vaka çalışmaları veya vaka serileri ile sınırlıdır. Gerçekten de, karşılaştırılabilir progresyonsuz sağkalım sağlarken daha düşük postoperatif komplikasyon oranları ve maliyetler dahil olmak üzere LITT için çeşitli potansiyel faydalar gösterilmiştir 7,8,9,10,11.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbion Spears	FST	18105-01	Hemostatic sponges.
Adson tissue forceps	FST	11006-12
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	Strain #000664	6 to 12 week old male and female
Cotton Tipped Applicators (6")	Electron Microscopy Sciences	72308
CT2A glioma cell line			Generously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University.
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear	Biotechne, R&D systems	3433-010-01
DMEM/F-12, HEPES	Gibco, ThermoFisher Scientific	11330032
Dual-chamber slides	BIO-RAD	1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL	Eppendorf	22363352
Ethyl Alcohol Anhydrous	Greenfield Global	P016EAAN	Dilute to 70% with ddH2O
Fetal Bovine Serum, qualified, Canada	Gibco, ThermoFisher Scientific	12483020
Glad Press-n-Seal plastic wrap	Amazon.ca	12587704417
High speed drill	Kopf Instruments	Model 1474
K & J Thermocouple temerpature meter	Omega	HH509R
Metacam (meloxicam)	WDDC	114424
Microinjection syringe pump	WPI	UMP3T-1
Microliter syringe (700 Series)	Hamilton	87908	Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability.
Needle driver/Needle Holder	FST	12500-12	A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference.
Opixcare Plus opthalmic ointment	WDDC	135941
Phosphate Buffered Saline (10x)	Fisher bioreagents	BP399-4	Dilute to 1x with ddH2O
Povidone-iodine	ThermoFisher Scientific	3955-16	Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators.
Saline (normal)	WDDC	126588
Scalpel, single use (#15 Blade)	Feather	Feather NO15
Scissors, fine surgical	FST	91460-11	Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable.
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 940	With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars.
Stereotactic syringe holder	Kopf Instruments	Model 1772-F	If not using an injection pump.
Sutures (5-0 monofilament)	Ethicon	MCP463G	Monocryl violet monofilament with reverse cutting tip
Syringe, 28 G  (0.5 mL)	BD	BD 329461	BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102
Thermocouple probe, fine diameter (Type K)	Omega	TJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25200072
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue	WDDC	126125
Wahl Peanut Clippers	WDDC/Wahl	100963	Also available directly from manufacturer.
Warming pad	Bensen Medical	70308/121873	Any similar item can be used.
Webcol Alcohol preps	Electron Microscopy Sciences	71005-20	Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size.