Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Özet

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Özet

Son araştırmalar, aterosklerozun, intima plağı, media ve arterlerin dış bağ dokusu kaplamasını oluşturan adventiti dahil olmak üzere arter duvarının üç katmanını da içeren transmural kronik inflamatuar bir hastalık olarak anlaşılmasını ilerletmiştir. Son çalışmalarımız, adventitinin periferik sinir sistemi tarafından tüm doku hücrelerine ulaşmak için bir kanal olarak kullanıldığını göstermiştir. Ayrıca periferik sinir sisteminin, yani duyusal ve sempatik sinir sisteminin, aterosklerotik plaklara bitişik akson ağlarının neogenezini içeren büyük yeniden şekillenme süreçlerinden geçtiğini bulduk. Bu bağlamda, sinir ağının yapısının ve hastalıklı arterlerin vasküler bileşenleri ile etkileşimlerinin anlaşılması, kardiyovasküler hastalık patogenezinin daha iyi anlaşılması için önemli vaatler içermektedir. Bu hedeflere ulaşmak için, sağlam sağlıklı ve hastalıklı arterlerin hücre altı mimarisini, çevrelerindeki perivasküler kompartmanlarla birlikte görselleştirmek için yöntemlere ihtiyaç vardır. Doku temizleme, başka türlü erişilemeyen daha büyük doku bölmelerinin sağlam derin doku görüntülemesine izin verir. Etiketleme, temizleme, gelişmiş mikroskobik görüntüleme ve görüntü işleme araçlarının entegrasyonu yoluyla sağlam arterlerin hacimsel olarak görüntülenmesine izin verir. Burada, iki farklı ancak tamamlayıcı pasif doku temizleme yaklaşımını, yani su bazlı 2, 2-tiyodietanol (TDE) temizleme ve solvent bazlı immünoetiketleme özellikli solventle temizlenmiş organın (iDISCO) tüm farede izole aort segmentlerini veya tüm aortu yerinde görüntülemek için temizlemeyi etkinleştiren üç boyutlu görüntülemeyi açıklıyoruz.

Giriş

Histolojik teknikler, dokuların/organların kesitlere ayrılması yoluyla biyolojik örneklerin temel bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bununla birlikte, karmaşık anatomik hücre/hücre ve doku/doku etkileşimlerinin üç boyutta (3D) tanımlanması - yakın zamana kadar - başarılması zor olmuştur. Bu karşılanmamış ihtiyaç, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda kardiyovasküler sistem bağlamında özellikle belirgindi. Sağlam dokuları görüntülemek, ışık emilimi ve ışık saçılımı nedeniyle geçmişte zor olmuştur ve bu da onları doğası gereği opak hale getirir. Doku temizleme, bu sınırlamaları en aza indirerek bozulmamış biyolojik numuneyi şeffaf hale getirir. Doku temizleme tekniklerindeki son gelişmeler, kesitsiz saydam dokuların yüksek çözünürlüklü 3D görüntülenmesini, mikrometre çözünürlükte tüm organların hücresel ve yapısal mikromimarisi hakkında önemli bilgiler sağlamak ve böylece anatomik bağlantı ağlarının tanımlanmasını mümkün kılar.

Ateroskleroz, iç intima tabakası, orta media tabakası ve adventiti olarak adlandırılan dış bağ dokusu tabakası dahil olmak üzere arter duvarının üç tabakasını içerir. Arterlerin iç tabakasındaki aterosklerotik plaklar, onlarca yıldır geleneksel bir araştırma hedefi olmuştur ^1,2. Bununla birlikte, adventitia tabakası, periferik sinir sisteminin kan damarlarını, lenf damarlarını ve sinir liflerini içerir. Ayrıca, adventitia, perivasküler yağ dokusu ve perivasküler gangliyonlar dahil olmak üzere perivasküler yağ dokusu ve nöronal doku bileşenlerine bağlıdır ^3,4. Periferik sinirlerin, adventitia'yı uzak hedef dokulara ve aslında hücrelere ulaşmak için kanal olarak kullandığı bilinmektedir⁵. Son çalışmalarımız, bağışıklık sistemi, sinir sistemi ve kardiyovasküler sistemi içeren ana biyolojik sistemlerin çok katmanlı etkileşimlerini anlamadaki ilerlemeyi ilerletmiştir. Bu etkileşimlere nöroimmün-kardiyovasküler arayüzler ^6,7 adını verdik. Aterogenez sırasında, arteriyel duvar bileşenleri sağlam bir yeniden yapılanma ve yeniden şekillenmeye uğrar. Örneğin, intimada aterosklerotik plak ilerlemesine bitişik olarak, immün hücre agregatları oluşur ve murin aort adventitinde^nöronal akson neogenezi meydana gelir ^6,8,9. Ateroskleroz ilerledikçe, bağışıklık hücresi agregatları, farklı T hücresi, B hücresi ve plazma hücresi alanları ile iyi yapılandırılmış arter üçüncül lenfoid organlara (ATLO'lar) dönüşür¹⁰. Bununla birlikte, bu değişiklikleri 3D olarak tanımlamak için, yetersiz membran geçirgenliği ve doğal ışık saçılımı nedeniyle sağlam dokunun yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi zor olmuştur¹¹. Doku temizleme yaklaşımları, konvansiyonel histoloji yaklaşımlarının 11,12,13,14,15 ana sınırlamalarının üstesinden gelerek, kırılma indisini (RI) düzgün bir şekilde ayarlayarak sağlam dokulara veya organlara derinlemesine ulaşmak için antikorların daha fazla penetrasyonu ile voksellerde daha yüksek görüntüleme derinliğine sahip mikrometre ölçeğinde çözünürlüklü görüntülere yol açmıştır. Numunelerin RI'ları, gliserol (RI 1.46) veya daldırma yağı (RI 1.52) ile eşleştirilebilir, böylece ışık saçılımını ve küresel sapmaları büyük ölçüde azaltarak yüksek çözünürlük sağlar. Sırasıyla sulu bazlı 2,2-tiyodietanol (TDE) ve çözücü ile temizlenmiş organların immüno-etiketleme özellikli 3D görüntülemesi (iDISCO) gibi tüm organ veya tüm vücut dokusu temizleme tekniklerindeki son gelişmeler, hacimsel görüntüleme teknikleri (konfokal, multifoton ve ışık tabakası mikroskobu görüntüleme dahil) ile birlikte, bağlantı atlasını oluşturarak vasküler mimarinin mikroanatomisinin yeniden yapılandırılmasına izin vermiştir^11,16. Bu hücresel ve yapısal bağlantıları 3D olarak görselleştirmek, şimdiye kadar cevaplanmamış biyolojik soruları cevaplamak için yeni bilgiler sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışma, yerel ve ulusal hayvan kullanımı ve bakımı komitesinin yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yaşlanma sırasında kendiliğinden ateroskleroz gelişen, standart bir kemirgen yemi diyetinde sürdürülen C57BL/6J arka planlı hiperlipidemik erkek Apoe^-/- fareler kullanıldı.

1. İzole aortun tam montajlı görüntülenmesi ve TDE temizlenmesi

1. Doku hazırlama
   1. Anestezik, fare başına 150 mg / kg Ketamin ve 30 mg / kg Xylazine ( Malzeme Tablosuna bakınız) olarak hazırlayın. Fareleri intraperitoneal enjeksiyonla derinlemesine uyuşturun ve bunu derin ağrı testine reaksiyon eksikliği ile doğrulayın.
      NOT: Enjeksiyonun konsantrasyonu ve hacmi aşağıdaki gibidir: Ketamin 100 mg / mL; Ksilazin 20 mg / mL; Enjeksiyon hacmi hacimce 50:50 3 μL/g'da ketamin ve ksilazin karışımı.
   2. Fareyi cerrahi kağıt havlularla kaplı bir köpük tabağa yerleştirin ve kolları ve bacakları bantlarla sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Göğsü% 75 etanol ile dezenfekte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha iyi perfüzyon için kanı çıkarmak için 1 mL tek kullanımlık bir şırınga ile sol ventrikül yoluyla kan alın.
      NOT: Torakotomi ile kardiyak kan alımı da kullanılabilir.
   3. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüste orta hat insizyonu ve transkardiyak perfüzyona izin vermek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapın. Fareyi sol ventrikül yoluyla 10 mL 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA; Malzeme Tablosuna bakınız) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 5 dakika boyunca perfüze edin, ardından kan akınana kadar 5-10 dakika boyunca 20 mL PBS uygulayın. Son olarak, 20 dakika boyunca 10 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.
      NOT: Tüm işlemler oda sıcaklığında (RT) 100-125 mm Hg basınçta peristaltik perfüzyon pompası ile yapılabilir. Perfüzyon iğnesi, kan ekstraksiyonu ile aynı delikten fare kalbine sokulur.
   4. Cerrahi aletler kullanarak dalak, karaciğer, akciğer ve gastrointestinal ve üreme organları dahil olmak üzere iç organları çıkarın. Kalbi, aortu ve böbrekleri yerinde sağlam tutun.
      NOT: Organların diseksiyonu ve çıkarılması için kullanılan cerrahi aletler diseksiyon makası, ince iris makası, yaylı makas, künt forseps, kavisli forseps ve kavisli ince forsepslerdir.
   5. Diseksiyon stereomikroskopu (30-40x büyütme) altında çıkan aorttan iliak bifurkasyona kadar tüm aortu ortaya çıkarın. Aortu yaralamadan timus ve yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
      NOT: Aortu kesmemeye dikkat edin. Apoe^-/- fareler için, bağlı yapı için aortun minimal çevrelenmiş perivasküler yağ dokusunu koruyun.
   6. Tüm aortu PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına hasat edin. Aortu farklı segmentlere ayırın ve TDE temizleme için Şekil 1A'da gösterilen sıra ve yönü takip ederek intimal yüzeyi ortaya çıkarmak için bir iris veya yaylı makas kullanarak tüm aortu uzunlamasına bölün.
   7. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, yüz aortunu Y şeklinde düz siyah balmumu plakasına sabitleyin. 4 °C'de gece boyunca %4 PFA'da sabitleyin.
      NOT: Aşağıdaki adımlarda katlanmayı ve kıvrılmayı önlemek için sabitlemeden önce aortu balmumu plakasına sabitleyin.
   8. Aortu çıkarın ve PBS'ye aktarın. Aortu 5 dakika boyunca 5 kez iyice yıkayın.
      NOT: Aortu yıkama için her seferinde PBS ile doldurulmuş farklı tüplere aktarın.
2. En-face aort için antikor boyaması
   NOT: Tüm inkübasyon adımları, RT'de hafif dönüş veya çalkalama ile 2 mL güvenli kilitli tüplerde gerçekleştirilir.
   1. Sabit aortu blokaj ve geçirgenlik için 2 saat boyunca bir blokaj solüsyonuna aktarın.
      NOT: Bloke edici çözelti, birincil ve ikincil antikorlara göre değişir. Örneğin, bloke etme çözeltisi: 0.5 mg / mL CD16 / 32 (1:100)% 10 normal eşek serumu,% 2 Triton X-100 PBS'de (bkz.
   2. Aortu yukarıdaki bloke edici solüsyondaki primer antikorlarla (adım 1.2.1), örneğin, CD3e (1:100 seyreltme), NF200 (1:200 seyreltme) ve B220 (1:200 seyreltme) ile 24 saat boyunca inkübe edin (bkz. Aortu PBS'de 5 dakika boyunca 5 kez yıkayın.
   3. Gece boyunca nükleer boyama için aortu %10 normal eşek serumu (1:300 seyreltme) ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 mg / mL) içinde ikincil antikorlarla inkübe edin (bkz. Aortu PBS'de 5 dakika 5 kez yıkayın ve doku temizleme işlemine kadar aortu PBS'de 4 °C'de saklayın.
      NOT: Aortu yıkama için her seferinde PBS ile doldurulmuş farklı tüplere aktarın. Adım 1.2.3 için karanlıkta tutmak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
3. TDE doku temizleme
   NOT: Tüm inkübasyon adımları, RT'de hafifçe döndürülen ve karanlıkta alüminyum folyo ile kaplanan 2 mL güvenli kilitli tüplerde gerçekleştirilir. TDE (Malzeme Tablosuna bakınız) çalışma çözümleri oldukça geçirgendir ve çeker ocakta dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Atıkları yerel yönetmeliklere göre toplayın ve atın.
   1. Lekeli aortu %20 TDE çalışma solüsyonlarına aktarın ve 1 saat inkübe edin.
   2. Aortu %47 TDE çalışma solüsyonlarına aktarın ve 12 saat inkübe edin. Aortu %60 TDE çalışma solüsyonlarına aktarın ve numuneler görünür ışıkta RI'ye uyacak şekilde şeffaf hale gelene kadar 24-36 saat inkübe edin.
   3. Aortu görüntülemeye kadar karanlıkta RT'de% 60 TDE'de saklayın.
      NOT: Çalışma solüsyonlarını kısa süreli inkübasyon için her 30 dakikada bir (örneğin, adım 1.3.1) ve uzun süreli inkübasyon için her 4 saatte bir (örneğin, adım 1.3.2) yenileyin. Her adım için inkübasyon süresi, daha iyi bir antikor penetrasyonu veya temizleme şeffaflığı elde etmek için doku boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir. Yağ dokusu ile çevrili Apoe^-/- fare aortu için kuluçka süresi uygun şekilde uzatılmalıdır.
4. TDE temizleme aortunun konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile görüntülenmesi
   1. Piyasada bulunan 0,2 mm kalınlığında çift taraflı yapışkan dikdörtgen görüntüleme ara parçası kuyuları kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). Kuyuyu temiz bir cam slayta yapıştırın ve temizlenmiş aortu aktarın. En yüz aort adventitisinin lamel ile baktığından emin olun.
      NOT: Açılı forseps kullanarak en yüz aortunun abluminal tarafı üstte olacak şekilde en yüz aortuna hafifçe vurun. Gerekirse doku boyutuna uyacak şekilde birden fazla görüntüleme ara parçası kuyusunu istifleyin.
   2. Aortu %60 TDE solüsyonu damlalarıyla monte edin. Numune ile lamel arasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyerek kuyuya dikkatlice bir lamel takın.
      NOT: Lamelden önce baloncukları bir iğne ile dikkatlice çıkarın. Numune etrafta yüzebileceğinden aşırı miktarda montaj solüsyonu kullanmayın.
   3. 20x daldırma (çoklu) objektif (NA: 0.75) ile donatılmış ters çevrilmiş bir CLSM cihazı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
      NOT: CLSM, aort adventitinde sinir çapının ve sinir-bağışıklık hücresi etkileşiminin analizi için gerekli olan daha yüksek çözünürlükte 70 μm derinliğe kadar hacimsel görüntülemeye izin verir.
   4. 20x/0,75 daldırma (yağ) hedefini seçin. Hibrit diyot dedektörlerini lekeli boyalara göre ayarlayın. Görüntü ayarlarını yapın ve görüntüleme için 1024 x 1024 piksel XY formatını seçin.
      NOT: Yağa daldırmalı objektif merceği, sinyalleri sudan daha iyi yakalar.
   5. Daldırma yağını (gliserollü) lamel üzerindeki aort boyunca eşit şekilde bırakın. 63x objektifi, daldırma yağına/lamel dokunana kadar kaba bir şekilde s'ye doğru hareket ettirin.
   6. İlgilenilen bölgeyi bulmak için 63x objektifi mikroskop altında ince bir şekilde hareket ettirin. 3D görüntüleme için 2-4 μm adım boyutunda 60 μm derinliğe kadar en face aortun adventitia tarafından Z-stack elde edin.
   7. Dosyayı örnek ayrıntılarıyla adlandırın, ayrıntıları tarayın ve verileri kaydedin.
5. TDE temizleme aortunun multifoton mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi
   1. 1.4.1-1.4.2 adımlarını izleyerek en yüz aortunu slayta monte edin.
   2. 1,5 mm derinliğe kadar hacimsel görüntülemeye izin veren 20x objektif (suya daldırma, NA: 1.00, çalışma mesafesi = 2 mm) ile donatılmış dik bir çoklu foton mikroskobu ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
   3. Abluminal taraftan 10-15 μm adım boyutunda 700 μm derinliğe kadar Z-yığınları elde edin. Dosyayı adlandırın ve verileri adım 1.4.7'deki gibi kaydedin.

2. Tüm vücut immün boyama ve iDISCO doku temizleme

1. Doku hazırlama
   1. Anestezi, fareyi sabitleme ve perfüzyon için yukarıdaki 1.1.1-1.1.3 adımlarını izleyin.
   2. Cerrahi aletler kullanarak dalak, karaciğer, akciğer ve gastrointestinal ve üreme organları dahil olmak üzere cildi ve iç organları çıkarın. Kalbi, aortu ve böbrekleri yerinde sağlam tutun.
   3. Vücut kısmını diyafram seviyesinin üzerinde inceleyin ve alt vücut kısmını 4 ° C'de 1-2 gün (s) boyunca% 4 PFA ile sabitleyin.
      NOT: Fiksasyon, yıkama ve inkübasyonları 50 mL'lik tüplerde hafifçe dönen bir çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirin. Solüsyonu yeni tüplerde 2-3 kez yenileyin.
   4. Numuneyi RT'de 3 kez 10 dakika boyunca iyice yıkayın.
      NOT: Aortu her seferinde PBS ile doldurulmuş farklı tüplere aktarın.
   5. Numuneyi, renk giderme için %20 berrak, engelsiz beyin/vücut görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz (CUBIC) solüsyonunda 48 saat inkübe edin.
      NOT:% 20 KÜBİK çözelti için, 25 g üreyi 15 mL Triton X-100 ve 28 mL Quadrol içinde çözün ve 100 mL'lik son hacme PBS ekleyin. Malzemeler uyarıcı olduğu için davlumbazda hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
   6. Numuneyi RT'de PBS'de beş kez 1 saat boyunca iyice yıkayın.
2. Antikor boyama
   NOT: Tüm inkübasyon adımları, 50 mL'lik güvenli kilitli tüplerde hafif dönüş veya 4 ° C'de çalkalama ile gerçekleştirilir.
   1. Numuneyi, geçirgenlik ve blokaj için gece boyunca PBS-jelatin-Triton X-100-serum (PGST) çözeltisi içinde inkübe edin.
      NOT: Bloke edici çözelti antikorlara göre değişir. Örneğin, bloke edici çözelti: PBS-jelatin-Triton X-100-serum (PGST, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi: PBS'de %0.2 domuz derisi jelatini, %0.5 Triton X-100 ve %5 keçi serumu.
   2. Numuneyi PGST çözeltisinde birincil antikorlarla, örneğin NF200 (1: 200 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de inkübe edin ve 10-12 gün boyunca hafifçe çalkalayın. Ardından, numuneyi RT'de 5 kez 1 saat boyunca PGST'de iyice yıkayın.
   3. Numuneyi ikincil antikor çözeltisi (1:300 seyreltme) ve DAPI (1 mg/mL) ile PGST'de 4 ° C'de 7 gün boyunca inkübe edin.
   4. Numuneyi RT'de 5 kez 1 saat boyunca PGST'de iyice yıkayın. Numuneyi PBS'ye aktarın ve daha sonraki adımlar için aortu PBS'de 4 ° C'de saklayın.
      NOT: 2.2.3-2.2.4 adımlarında karanlık kalmalarını sağlamak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
3. Modifiye iDISCO doku temizleme
   NOT: Temizleme sırasında, doğrudan doğal/yapay ışığa maruz kalma nedeniyle sinyal ağartmasını/söndürülmesini önlemek için tüpler alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. DISCO temizlemede kullanılan tüm organik reaktifler zararlıdır ve tüm temizleme adımları bir çeker ocakta yapılmalıdır. Solunmasını ve cilt ve gözlerle temasını önlemek için reaktiflerle uğraşırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske kullanın. Temizleme atıklarını toplayın ve davlumbazdaki uygun atık kaplarına boşaltın.
   1. Lekeli numuneleri adım 2.2.4'ten dehidrasyon için bir dizi artan konsantrasyonda tetrahidrofuran (THF, Malzeme Tablosuna bakınız) çalışma solüsyonlarına, yani %50, %70, %90 ve %100 (iki kez %100) aktarın. Konsantrasyon başına 12 saat inkübe edin.
      NOT: Davlumbazda farklı konsantrasyonlarda çalışma çözeltileri için THF reaktifini (%99 -%100) damıtılmış suda seyreltin. Çalışma çözümlerini her 6 saatte bir yenileyin.
   2. Numuneyi, lipidin uzaklaştırılması için 3 saat boyunca mutlak diklorometan (DCM, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisine aktarın.
   3. Numuneyi RI eşleşen benzil-alkol-benzil-benzoat (BABB) çalışma çözeltisine aktarın (Malzeme Tablosuna bakın). Doku yarı saydam olana ve görünür ışıkta çoğunlukla şeffaf olana kadar 3-6 saat inkübe edin.
      NOT: BABB çalışma solüsyonunu hazırlamak için 1 kısım benzil alkol ve 2 kısım benzil benzoatı (1:2) bir cam şişede karıştırın. Davlumbazda 5 dakika boyunca hafifçe sallayın.
4. Işık tabakası mikroskobu kullanılarak iDISCO temizleme dokusunun görüntülenmesi
   NOT: Temizlenmiş s'yi görüntüleyinampoptimum şeffaflık elde edilir edilmez elde edilir. Görüntüleme için ultramikroskop-II gibi bir ışık tabakası mikroskobu (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır. Görüntüleme haznesini son temizleme solüsyonu olan BABB solüsyonu ile doldurun. Aletin hasar görmesini önlemek için BABB'ı aletin üzerine dökmemeye dikkat edin.
   1. Tüm numunenin tüm genişliğini kaplayan düşük büyütmeli görüntüler için 1x hava objektifi kullanın. Numuneyi temizleme solüsyonundan nazikçe bir kağıt bez üzerine aktarın ve kısa bir süre kurulayın.
      NOT: Numuneyi sıkmamak için künt forseps kullanın.
   2. Numune/doku boyutuna göre uygun boyutta bir numune tutucu seçin ve numunenin arka tarafını süper yapıştırıcı ile numune tutucuya takın.
      NOT: Numune numune tutucuya sıkıca takılana kadar 1-2 dakika bekleyin.
   3. Işık tabakası mikroskobunun görüntüleme rezervuarını BABB solüsyonu ile doldurun ve numuneyi yavaşça içine yerleştirin. Numunenin ışık tabakasına dik olduğundan ve düzgün şekilde aydınlatıldığından emin olmak için numune tutucuyu ayarlayın.
   4. Örneğe odaklanmak için hedefi düşürün ve örneği düzgün bir şekilde görüntülemek için odaklanırken görüntü ayarlarını yapın. Mikroskop yazılımında uygun ışık tabakasını (tabakalarını) seçin ve tüm görüş alanını eşit şekilde aydınlatmak için genişliğini ayarlayın.
      NOT: Her iki tarafı lazer aydınlatmalı bir ultramikroskop sisteminde, lazeri bir tarafa hizalayarak ve odaklayarak başlayın. Her iki taraf da ayarlandıktan sonra, her iki aydınlatmadan birleştirilmiş bir tarama görüntüsünü gözlemlemek için her iki yan lazeri etkinleştirin.
   5. NF200 ile boyanmış nöronal yapıları görüntülemek için uzak kırmızı bir kanal (680 nm) ve boyanmamış aort ve bağ dokularını görüntülemek için bir otofloresan kanal (488 nm) seçin. Optimum sinyal-gürültü oranı, pozlama süresi ve ışık levhalarının genişliği için floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak lazer gücünü ayarlayın.
   6. x-y-z tarama modunu seçin. Z-yığını taramasını 2-8 μm'lik bir z adımıyla ayarlayın ve tüm numune hacmini (6-8 mm derinliğe kadar) görüntülemek için numunelerin ventral ve dorsal yüzeylerini kaplayan karo taramalarının (16 bit) uzunlamasına y ekseni boyunca %25-60 örtüşmeyi seçin.
   7. Tarama tarihi, numune adı, kullanılan antikor, amaç, yakınlaştırma faktörü, z adımları ve kullanılan lazerler dahil olmak üzere ayrıntılı bilgilerle taramayı adlandırın. Verileri kaydedin.
   8. İlgilenilen belirli vücut bölgelerini görüntülemek için yakınlaştırma işleviyle daha yüksek bir büyütme oranına (2x veya 4x) geçin.
   9. Görüntüleme için yukarıdaki 2.4.4-2.4.7 adımlarını izleyin ve verileri kaydedin.

3. Görüntü işleme ve analizleri

NOT: İşleme için yüksek güçlü bir işleme iş istasyonu gereklidir. Yüksek görüntüleme hacmi (görüntü başına 5-100 GB) nedeniyle işlemden hemen sonra veri yedeklemesini sağlayın.

1. CLSM ve çoklu foton görüntülerin görüntü işleme
   1. CLSM ve çoklu foton mikroskoplarından gelen Z-yığını döşemeli görüntüleri, 3B ve iki boyutlu (2D) görselleştirme, segmentasyon ve niceleme için Las X, Imaris (görüntü analiz yazılımı) veya Fiji yazılımı ile donatılmış görüntü işleme iş istasyonuna yükleyin.
   2. Bir hücrenin veya yapının hacim derinliğini renk kodlaması yapmak için, ham görüntüyü evrişimden çıkarmak ve Las X veya Fiji'de zamansal renk kodlaması kullanarak evrişimi kaldırılmış verilerin maksimum yoğunluk projeksiyonunu oluşturmak için görüntü restorasyon yazılımını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
2. Işık sayfası görüntülerinin görüntü işleme
   1. Z-stack döşemeli TIFF görüntü serisini Fiji yazılımına yükleyin. Fiji'nin dikiş eklentisiyle görüntüleri birleştirin ve dikişli görüntüleri TIFF formatında kaydedin.
      NOT: Gerekirse, farklı yazılımlarla hızlı işlemeye izin vermek için dikişli görüntüleri LZW formatında sıkıştırın.
   2. Görüntü segmentasyonu için dikişli görüntüleri 3B görselleştirme yazılımına ( Malzeme Tablosuna bakın) yükleyin. Nöronal ve vasküler yapıları x-y-z ekseninde manuel olarak izleyin. Küçük sinir liflerinin manuel olarak izlenmesi için, aort ve gangliyonlar arasındaki sinir lifinin tüm yolu boyunca her z düzleminde NF200⁺ sinyallerini piksel piksel manuel olarak seçin.
   3. Görüntülerin video oluşturma, 2D ve 3D görselleştirmesi için önceden işlenmiş görüntüleri görüntü analiz yazılımına ( Malzeme Tablosuna bakın) yükleyin.
   4. Görüntü analiz yazılımında aort ve lenf düğümleri ve kas dahil olmak üzere bağ dokularını segmentlere ayırmak için otofloresan kullanın. Aort duvarı ve plak gibi farklı aort segmentlerini görselleştirmek için görüntü analiz yazılımında ayrı sahte renkler uygulayın.
   5. İşlenen görüntülerin arka planı üzerindeki yerel kontrastı geliştirmek için Fiji yazılımındaki kontrast sınırlı uyarlanabilir histogram eşitleme (CLAHE) işlevini kullanın.

Sonuçlar

Sağlam sağlıklı ve hastalıklı aortun mikroanatomisini göstermek ve aterosklerozun fare modellerinde bağışıklık sistemi, sinir sistemi ve kardiyovasküler sistem arasındaki fiziksel bağlantıları ortaya çıkarmak için iki tamamlayıcı doku temizleme yaklaşımı kullandık: izole aortun TDE temizlemesi ve tüm farenin iDISCO temizlemesi (Şekil 1). Tam montajlı immün boyamadan sonra, enface aort bir dizi TDE çalışma solüsyonu ...

Tartışmalar

Ateroskleroz, arter duvarının üç tabakasını da içeren arterlerin transmural inflamatuar bir hastalığı olarak görülebilir. Ayrıca, arterler perivasküler yağ ve nöronal dokularla çevrilidir. Ateroskleroz ilerlemesi sırasında, bu dokuların her biri, sağlıklı ve hastalıklı arterleri çevreleyen sağlam dokulara hücre altı optik erişim elde etmek için yöntemler gerektiren önemli hücresel ve yapısal değişikliklere uğrar. Bu yöntemler, hücre-hücre ve hücr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic