Eucommia ulmoides Kabuğu Özü Kullanılarak Çinko Bazlı Nanomalzemelerin Formülasyonu ve Yara İyileştirme Potansiyelleri

Özet

Burada, Eucommia ulmoides ağaç kabuğundan elde edilen poliizopren bakımından zengin sulu ekstraktı kullanarak çinko oksit (ZnO) nanopartiküllerini sentezlemek için bir protokol sunuyoruz. Sentezlenen ZnO nanopartiküllerinin insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC'ler) üzerinde sergilediği yara iyileşme potansiyeli, basit, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem olan çizik testi kullanılarak değerlendirildi.

Özet

Eucommia ulmoides'in kabuğundan elde edilen sulu ekstrakt, sayısız sağlık yararına sahip zengin bir biyoaktif bileşik kaynağı olarak hizmet eder. Buradaki protokol, Eucommia ulmoides kabuğu aracılı poliizopren bakımından zengin sulu ekstrakt kullanılarak çinko oksit (ZnO) nanopartiküllerinin hazırlanmasını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu arada, önerilen protokol, süreci kolaylaştırarak yara iyileştirici materyalin hazırlanması ile ilişkilidir. Ek olarak, sentezlenen nanopartiküllerin (Eu-ZnO-NP'ler) yara iyileşme potansiyeli, bir insan göbek veni endotel hücresi (HUVEC) tek tabakası üzerinde basit bir çizik testi kullanılarak değerlendirildi. Eu-ZnO-NP'lerle 24 saatlik tedaviden sonra, HUVEC hücrelerinin hücre proliferasyonu ve göçü değerlendirildi. Çalışmanın sonunda, farklı konsantrasyonlarda Eu-ZnO-NP ile muamele edilmiş çizik tek tabakada hücre proliferasyonu ve migrasyonu gözlenirken, kontrol hücrelerinde zayıf hücre migrasyonu ve proliferasyon oranları gözlenmiştir. Seçilen konsantrasyonlardan 20 μg/mL Eu-ZnO nanomalzemeler daha iyi hücre göçü ve gelişmiş yara iyileşme potansiyeli gösterdi.

Giriş

Tıbbi bitkiler ve bitki türevli bileşiklerin çok sayıda sağlık yararı sergilediği gösterilmiştir¹. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), küresel nüfusun %80'inin birinci basamak sağlık hizmetleri için geleneksel şifalı bitkilere bağımlı olduğunu bildirmiştir. Çin, Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) uygulamalarıyla tanınmakta ve popülerdir. Çin şifalı bitkilerinin çeşitli hastalıkları tedavi ettiği ve biyolojik potansiyelleri için kullanıldığı bildirilmiştir. Tıbbi bitkiler, biyoaktif bileşikler ve çoklu terapötik roller için rezervuar görevi görür. Yaraları tedavi etmek için şifalı bitkiler de kullanılmıştır. Kronik yaraları tedavi etmek için uygulanan çeşitli yaklaşımlar vardır². Yakın zamanda yapılan bir araştırma, şifalı bitkilerin iyileşme için uygun koşullar sağlayarak, enfeksiyonlardan arınmış ve doku yenilenmesini hızlandırarak yara iyileşme sürecine dahil olduğunu ortaya koymuştur³. Bu arada, şifalı bitkilerde bulunan biyoaktif bileşiklerin antibakteriyel ve antifungal özellikleri, yaraları iyileştirmeye ve yara iyileşme verimliliğini hızlandırmaya yardımcı olabilir⁴.

Metal bazlı nanomalzemeler, biyouyumlu ve biyobozunur olmaları nedeniyle dikkat çekmektedir. Yaygın olarak Çin kauçuk ağacı olarak adlandırılan Eucommia ulmoides, Çin'in yerli bir türüdür. Ağacın yaprakları ve kabuğu tıbbi uygulamalarda kullanılır. En önemlisi, bitki türleri Çin'in orta ve batı eyaletlerinde yetiştirildi⁵. Peng ve ^ark.6, yaprakların, kabukların ve staminat çiçeklerin terapötik potansiyele sahip yenilebilir olduğunu bildirmiştir. Ek olarak, E. ulmoides lignans, fenilpropanoidler, iridoidler, flavonoidler, amino asitler ve eser elementlerin en iyi kaynağı olarak hizmet eder. Ayrıca kabuk, kan basıncını kontrol etmek, yağı düşürmek ve antiosteroporoz ve hipoglisemik aktiviteyi teşvik etmek gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar için kullanılmıştır⁷. Bu nedenle, kuşkusuz, E. ulmoides kabuğu ekstraktının geleneksel Çin tıbbında uzun bir geçmişi olduğu kanıtlanmıştır. Daha önceki raporlar, doğal polimer poliizoprenin Eucommia ulmoides^8'in kabukları açısından zengin olduğunu öne sürdü. Yukarıdaki bilgilere dayanarak, bu çalışma, Eucommia ulmoides kabuğu özlerini kullanarak nanomalzemeler üretmeyi amaçlamaktadır. Çinkonun kabuk özü ile kombinasyonu, nanomalzemelerin hazırlanması için çekici bir seçimdir. Genel olarak, mevcut araştırmanın nihai amacı, yara iyileşme uygulamaları için yeni bir hibrit nanomalzeme üretmekti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Ekstrakt hazırlanmadan önce, elde edilen kabuk materyali deiyonize su kullanılarak iki kez yıkanmış ve gölgeli bir yerde kurutulmuştur. Gölgede kurutulmuş kabuklar hava geçirmez bir kapta saklandı.

1. Eucommia ulmoides kabuğu ekstraktının hazırlanması

1. Eucommia ulmoides ağacından toplanan kabuğu makas yardımıyla küçük parçalara ayırın.
2. Kıyılmış kabuk malzemelerini çift damıtılmış su ile iki kez yıkayın.
3. Kabuk parçalarını 37 °C'nin altında 24 saat gölgeli koşullarda kurutun.
   1. Kurutma işleminin süresini, çalışma için kullanılan kabuk miktarına göre ayarlayın. Kabukları küçük parçalar halinde doğramadan önce kabukların tamamen kuruduğundan emin olun. Doğrudan güneş ışığından kaçının.
4. 20 g gölgede kurutulmuş kabuğu 220 mL steril çift damıtılmış su içeren konik bir şişeye aktarın ve 130 °C'de 20 dakika ısıtın.
   1. Reaksiyon çözeltisinin rengi açık sarıya döner. Çözeltinin rengindeki değişiklikler 10 dakika sonra ortaya çıkar. Çözeltinin 10 dakika daha ısınmasına izin verin. Numune miktarına göre çift damıtılmış suyun hacmini ayarlayın.
5. Poliizopren içeren ham ekstraktı daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. İplik benzeri bir yapının oluşumu, ekstraktlarda poliizopren varlığını gösterir.

2. E. ulmoides kabuğu aracılı ZnO nanopartiküllerinin biyosentezi

1. 500 mL'lik bir şişeye 1 M Çinko nitrat dihidrat Zn (_NO3)₂ ila 50 mL deiyonize su ekleyin. Manyetik karıştırma (60 RPM) kullanarak sürekli karıştırın. Zn (NO₃)_2'nin tamamen çözünmesi 30 dakika sürer.
2. 20 mL 1 M Çinko nitrat dihidrat (Zn (_NO3)₂) çözeltisine damla damla 15 mL E. ulmoides kabuğu özütü ekleyin.
3. Kapalı reaksiyon karışımını manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin, karıştırıcıyı açın ve 60 saat boyunca (3 RPM) döndürün.
4. PH'ı 9'a ayarlamak için reaksiyon karışımına damla damla 1 N sodyum hidroksit NaOH (3 mL) çözeltisi ekleyin. Çözelti karışımı süt beyazına dönene ve pH 9'dan fazla olmayana kadar NaOH ekleyin. ZnO nanopartikülleri oluştuğunda çözelti süt beyazı bir renk alır.
   1. 1 M Çinko nitrat dihidrat Zn (_NO3)₂ çözelti hacminin hazırlanması deneysel ihtiyaçlara göre değişebilir. Taze hazırlanmış kabuk özlerini kullandığınızdan emin olun. PH 10'u aşarsa, nanopartikül agregasyonu ile sonuçlanacaktır.
5. Sentezlenen Eu-ZnO-NP'leri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Kirlilikler hemen yıkama ile önlenebilir.
6. Yıkanmış Eu-ZnO-NP'leri bir cam tabakta toplayın ve sıcak hava fırınında 1 saat boyunca 45-50 °C'de kurutun.
   NOT: Eu-ZnO-NP'ler 30 dakikadan fazla tutulursa, nanopartiküllerin fizikokimyasal yapısını etkileyebilir

3. TEM kullanarak boyut onayı

1. DDH 2O'da 1 mg / mL nanopartikül hazırlayınve bakır ızgaraya 5 μL Eu-ZnO-NP numunesi yükleyin ve tamamen kuruyana kadar bekleyin. Bakır ızgaraya yüklemeden önce numuneyi vorteksleyin.
2. Eu-ZnO-NP'leri içeren bakır ızgarayı TEM numune tutucusuna yükleyin ve 50x ve 100x büyütmelerde görüntüler elde edin.
   NOT: Bu adım sırasında ızgaralar cımbız kullanılarak alınmalıdır.

4. Sitotoksisite değerlendirmesi

1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 ×^{10 4} HUVEC tohumlayın ve %5 CO₂ 37 °C inkübatöre koyun.
2. % 90 birleşik hücrelere 10 μL çeşitli konsantrasyonlarda 0, 10, 20, 30, 40 ve 50 μg / mL Eu-ZnO-NP ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, hücreleri rahatsız etmeden eski ortamı çıkarın, 90 μL taze DMEM ortamı içeren her oyuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin ve% 5 CO₂, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
4. Bir spektrofotometre kullanarak 450 nm'de CCK8 çözeltisi ile muamele edilen hücrelerin emilimini ölçün.
   NOT: Absorbanstaki değişiklikleri önlemek için absorbans hemen 15 dakika içinde ölçülmüştür.

5. Çizik testi için HUVEC hücrelerinin hazırlanması

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 pen-strep içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerini içeren 12 kuyucuklu kültür plakasına uygun (1 × 10,⁵) miktarda HUVEC tohumlayın ve %5 CO₂ 37 °C inkübatörde inkübe edin.
   1. Çizik tahlilini gerçekleştirmeden önce, ters çevrilmiş mikroskobu kullanarak birleşmeyi kontrol edin.
      NOT: Çizik testini gerçekleştirmek için gereksinimlere göre 6 kuyulu plaka veya 12 kuyulu plaka kullanılacaktır ve hücre yoğunluğu farklı kültür plakaları için değişecektir. % 70 -% 80 birleşik hücrelerin kullanımı idealdir ve çizik testi için önerilir. DMEM ortamının hacmi, çalışmada kullanılan kültür plakalarına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, 6 oyuklu plaka 1-1.5 mL kültür ortamı gerektirir ve 12 oyuklu plaka 0.5-1.0 mL büyüme ortamı gerektirir.
2. 200 μm yara genişliğine sahip temsili yarada steril 200 μL pipet ucu kullanarak nazikçe çizik yapın.
3. Hücre tek tabakasında çizik yapmak için kullanılan ucun hücrelerin yüzeyi ile temas ettiğinden emin olun.
   NOT: Her çizik yapıldığında steril ucu kullanın.
4. Ortamın tamamını çıkarın ve ayrılan hücreleri çıkarmak için 1 mL 1x PBS kullanarak HUVEC tek tabakasını yıkayın.
   NOT: Ayrılmış tek katmanlı hücrelerin ilgili kuyucuklardan tamamen çıkarıldığından emin olun. Yara oluşturulan bölgede herhangi bir hasar meydana gelmediğini onaylayın.
5. Sentezlenen Eu-ZnO-NP'lerin yara iyileşme potansiyelini değerlendirmek için, kuyucuklara 0 (Kontrol), 10 ve 20 μg/mL konsantrasyonlarda %10 FBS içeren tam bir ortam ile birleştirilmiş Eu-ZnO nanopartikülleri ekleyin. Deney plakalarını %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de tutun.
   NOT: Taze, eksiksiz ortamı eklerken hücre tek katmanını rahatsız etmeyin. Tek katmanlı hücrelerin inkübasyon sırasında rahatsız edilmediğinden emin olun.
6. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak 0 saat ve 24 saatte mikrofoto elde edin. Yara kapanmasını farklı zaman aralıklarında ölçmek için açıklama aracını kullanın.
   1. Aşağıdaki formülü kullanarak yara kapanma yüzdesini hesaplayın: Yara kapanması (%) = [(0 saatte hücre göçü (μm cinsinden) - 24 saatte hücre göçü (μm cinsinden))/ 0 saatte hücre göçü (μm cinsinden)] x 100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu araştırma, Eucommia ulmoides ağacının kabuklarını kullanarak nanopartikülleri sentezlemeyi amaçlamaktadır. Kabuk materyali gölgeli bir ortamda tamamen kurutulmuştur (Şekil 1). Kabuk malzemeleri, numuneleri 130 °C'de 20 dakika ısıtarak sıcak su sulu ham ekstraktını hazırlamak için kullanıldı. Sıcaklık ve süredeki hafif bir değişiklik, fitobileşikleri bozabilir ve onları sulu ekstraktın hazırlanması için uygun hale...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

E. ulmoides kabuğu, tohumu ve yapraklarının çok sayıda sağlık yararı gösterdiğine inanılmaktadır. Sonuçlarımız, EU-ZnO nanopartiküllerinin sentezinin basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım kullanılarak elde edildiğini göstermiştir. Sulu ekstrakt, nanopartikülleri sentezlemek için kullanıldı. Kabuk materyalinin yüksek sıcaklıklarda ısıtılması, bazı bitki bileşenlerinin bozulmasına ve ekstraksiyon verimliliğinin düşmesine neden olabilir. Sulu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis