JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada kullanılan deney, geleneksel Çin tıbbının küçük molekülleri ile protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için prob teknolojileriyle birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Özet

Deubikitinasyon enzimleri (DUB'ler), ubikitinasyon homeostazını modüle etmede çok önemli bir rol oynar ve UCHL3, sayısız fizyolojik ve patolojik süreçte karmaşık bir şekilde yer alan bir arketipsel sistein DUB'dur. Bu nedenle, Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3'ü (UCHL3) hedefleyen küçük moleküllü inhibitörlerin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu protokol, UCHL3 ile temsil edilen küçük moleküllü sistein DUB inhibitörlerinin sanal taraması ve in vitro validasyonu için bir süreç oluşturmayı amaçlamaktadır. İlk olarak, UCHL3'ün potansiyel inhibitörleri, moleküler yerleştirme teknolojisi kullanılarak sanal olarak taranır ve ilaçlar ile protein hedefleri arasındaki etkileşim görselleştirilir. Daha sonra, taranan ilacın etkinliği olan Danshensu, in vitro aktivite inhibisyon testleri ile doğrulanır. Ubikitin-7-amino-4-metilkumarin (Ub-AMC) ve hemaglutinin-ubikitin-vinil sülfon (HA-Ub-VS), UCHL3'ün aktivitesini değerlendirmek için küçük molekül inhibitörleri ile DUB'a rekabetçi bir şekilde bağlanabildikleri için in vitro aktivite testi için problar olarak kullanılır. Sonuçlar, Danshensu'nun moleküler yerleştirmede UCHL3 ile iyi bir bağlanma afinitesine sahip olduğunu ve UCHL3'ün aktivitesini HA-Ub-VS ile rekabetçi bir şekilde inhibe edebileceğini göstermektedir. Bu bulgular, UCHL3'ü hedefleyen terapötik ilaçların daha fazla araştırılması ve geliştirilmesi için önemli referanslar sağlar.

Giriş

Ubikitinasyon, E1 ubikitin aktive edici enzimlerin, E2 ubikitin konjuge edici enzimlerin ve E3 ubikitin ligazlarının hedef proteine ubikuitini bağladığı bir süreç olan proteinlerin translasyon sonrası bir modifikasyonudur ve tüm ubikitinasyon süreci, deubikuitinasyon enzimleri (DUB'lar) tarafından tersine çevrilebilir1,2,3,4. Önemli fizyolojik ve patolojik rolleri nedeniyle, DUB'lar ilaç keşfi için önemli hedefler olarak kabul edilmektedir 5,6.

İnsanlarda 100'den fazla DUB tanımlanmıştır 7,8. Tipik olarak, ubikitinin C-terminali ile bir substrat veya başka bir ubikitin molekülü 9,10'daki bir lizin kalıntısı arasındaki izopeptit bağını parçalamaktan sorumlu bir izopeptidaz olarak işlev görürler. Şu anda, esas olarak yedi ana aileye kategorize edilmektedirler: ubikitin spesifik peptidazlar (USP'ler), yumurtalık tümör proteazları (OTU'lar), Jab1 / Mov34 / Mpr1 Pad 1 N-terminal + alan proteazları (JAMM'ler), ubikitin içeren yeni DUB ailesi proteazları (MINDY'ler), ubikitin C-terminal hidroksilazlar (UCH'ler), Machado-Josephin alan proteazları (MJD'ler) ve çinko parmak içeren ubikitin peptidaz 1 (ZUP1) ile etkileşime giren motif9. Çinko metalloprotaz ailesine11 ait olan JAMM'lere ek olarak, diğer DUB'lar, katalitik sistein, histidin ve üçüncü bir asidik kalıntıdan oluşan bir katalitik triad ile karakterize edilen sistein proteazlarıdır 12,13. Bu özgüllük, enzimin aktif bölgesini veya yakındaki allosterik cepleri hedef alan küçük moleküllü inhibitörler geliştirmek için yollar açar.

Deubikitinasyon enzim araştırmaları alanında, aktivitelerini karakterize etmede önemli bir zorluk vardır14,15. Aktif problara dayalı karakterizasyon, DUB inhibitörlerini incelemek için çok önemli bir yaklaşım olarak hizmet eder16. Hücre lizatlarında veya rekombinant proteinlerde aktivite bazlı problar ve inhibitörler ile rekabetçi testler yaparak, DUB'ların aktivitesi karakterize edilebilir ve bu enzimleri hedefleyen küçük moleküllü inhibitörlerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Ub-AMC, ubikitin17,18'in C-terminal ucuna bağlı bir floresan grubuna sahip olan DUB aktivitesini tespit etmek için kullanılan erken bir probdur. DUB'lar katalitik aktivitelerini uyguladıklarında, AMC büyük miktarlarda salınır ve algılanan ışığının floresan yoğunluğu buna göre arttırılır. Bu prob, DUB inhibitörlerinin19,20 yüksek verimli taramasında yaygın olarak kullanılmaktadır. HA-Ub-VS probu ayrıca DUB aktivitesini ölçmek için de kullanılır21. Ubiquitin'in C-terminalinde bir vinil sülfon grubuna sahiptir ve bu da onu DUB'lar için bir intihar substratı haline getirir. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid Jel elektroforezi (SDS-PAGE) ayrımından sonra, aktif DUB'lar western blotlama 22,23,24 kullanılarak tespit edilebilir.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), 2000 yıldan fazla bir süredir şifalı bitkileri kullanmaktadır. Doğal ürünlerden yeni ilaçlar geliştirmek, aktif bileşenlerin tanımlanması ve mekanizmalarının aydınlatılmasına odaklanan büyük tıbbi öneme sahiptir25. Salvia miltiorrhiza Bge, kanser, kardiyovasküler, karaciğer ve nörolojik26 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir bitkidir. Şu anda, tanshinone27, Danshensu28, tanshinic acid29 vb. gibi bilinen küçük moleküller içerir. Bu bileşikler, anti-trombotik, antioksidan ve anti-tümör etkileri gibi çeşitli biyolojik aktiviteler sergiler ve bu da onları araştırma için oldukça değerli kılar26. Son çalışmalar, Danshensu'yu SARS-CoV-230'un 3-kimotripsin benzeri proteazının (3CLpro) kovalent bir inhibitörü olarak tanımlamıştır. 3CLpro'nun aktif bölge kalıntısı C145 ile kovalent bir bağ oluşturduğu gösterilmiştir, bu da Salvia miltiorrhiza Bge'de potansiyel küçük moleküllü proteaz inhibitörlerinin varlığını gösterir.

Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3 (UCHL3), UCH DUB ailesi içindeki sistein proteazlarına aittir. İşlevlerini etkili bir şekilde katalize etmek için sistein95, histidin169 ve aspartik asit184 gibi korunmuş kalıntılara dayanır31,32. Hücre döngüsü, homolog rekombinasyon ve proteine bağlı DNA kırıklarının onarımı dahil olmak üzere çoklu moleküler yollarda çok önemli roller oynar33. Ek olarak, yumurtalık, prostat, pankreas, kolorektal ve küçük hücreli dışı akciğer kanserleri gibi çeşitli kanserlerde yukarı regüle edilir34. Bu çalışmalara dayanarak, UCHL3 hastalıkların tedavisi için umut verici bir hedef gibi görünmektedir. UCHL3'ün birkaç küçük molekül inhibitörü tanımlanmıştır ve klinik kullanıma doğru ilerlemektedir35,36.

Bu çalışmada, Salvia miltiorrhiza Bge ve UCHL3'ten küçük moleküller arasındaki etkileşimleri araştırmak için moleküler yerleştirme yapıldı. Daha sonra, DUB'a özgü problar Ub-AMC ve HA-Ub-VS kullanılarak yapılan bir in vitro deney, Danshensu'yu küçük bir molekül UCHL3 inhibitörü olarak tanımladı. Moleküler yerleştirme ayrıca Danshensu için potansiyel bağlanma bölgelerini öngördü ve bu da etki mekanizmasını düşündürdü.

Protokol

1. Salvia miltiorrhiza Bge ve UCHL3'ün küçük moleküllerinin yapılarının indirilmesi

  1. Küçük molekül dosyasını indirin.
    1. TCMSP veritabanını (https://old.tcmsp-e.com) açın, danshen (bitki adı) girin, ardından aramaya basın ve sonuç listesinde Radix Salviae'yi tıklayın.
    2. Öğelerden tek tek indirmeye tıklayın ve 2B yapıyı .mol2 formatında kaydedin .
  2. Protein dosyasını indirin.
    1. PDB veritabanını (https://www.rcsb.org/) açın, UCHL3 girin ve ardından aramaya basın. Homo sapiens'i tıklayın, ardından ayrıntılarda ara tuşuna basın.
    2. Küçük molekül-protein kokristalizasyonuna sahip 1XD3 yapısını seçin, ardından dosyaları indir'e tıklayın ve PDB formatını seçin.

2. Moleküler yerleştirme

  1. Dosyayı kaydedin.
    1. Masaüstünde danshen_UCHL3 yerleştirme adlı yeni bir klasör oluşturun ve Salvia miltiorrhiza Bge ve UCHL3 yapılarının bileşiklerini bu klasöre kaydedin. Klasörü İngilizce olarak adlandırın; aksi takdirde, dosya içe aktarılamaz.
  2. Yolu ayarlayın.
    1. Maestro yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın, Çalışma Dizinini Değiştir'e tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın, danshen_CUHL3 yerleştirme klasörünü seçmek için çift tıklayın ve Seçenekler'e tıklayın.
  3. Küçük molekül işleme
    1. Küçük moleküllü yapıları içe aktarın.
      1. Dosya ve Yapıları İçe Aktar seçeneklerini tıklatın. Masaüstü'ne tıklayın, yerleştirme klasörüne çift tıklayın ve Salvia miltiorrhiza Bge yapı dosyasına tıklayın. Ardından, tüm küçük molekülleri içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
    2. Küçük molekülü hazırlayın.
      1. Görevler'e tıklayın ve LigPrep seçeneğini belirleyin. Görüntülenen LigPrep penceresinde, Yapıyı kullan seçeneğindeki proje tablosuna tıklayın, hesaplama altındaki 3B yapıdan kiraliteleri belirle seçeneğini işaretleyin ve diğer tüm yazılım ayarlarını varsayılan olarak bırakın.
      2. İş adını danshen_ligprep1 olarak değiştirin ve ardından küçük molekül işlemeyi yürütmek için Çalıştır'a tıklayın.
  4. Protein yapısı işleme
    1. Protein yapısını içe aktarın.
      1. Dosya ve Yapıları İçe Aktar seçeneklerine tıklayın, Masaüstü'ne tıklayın ve danshen_CUHL3 yerleştirme klasörüne çift tıklayın.
      2. UCHL3 protein yapısı dosyasına tıklayın ve ardından protein yapısı dosyasını içe aktarmak için Aç'a tıklayın.
    2. Proteini hazırlayın.
      1. UCHL3 ile küçük molekülü birbirine bağlayan iki kovalent bağı seçin ve Sil düğmesini kullanarak bunları silin. Ardından, silme işleminden sonra eksik olan iki protein kalıntısını seçin. Oluştur düğmesine tıklayın, Diğer düzenlemeler'i seçin ve ardından Gly75 için C düğmesine tıklayın, Cys95 için Kalıntıyı Değiştir ve CYS'yi seçin.
      2. Görevler'e tıklayın ve Protein Hazırlama İş Akışı seçeneğini belirleyin. Diğer tüm yazılım ayarlarını varsayılan olarak bırakın. İş adını UCHL3_protein pre olarak değiştirin, ardından protein işlemeyi gerçekleştirmek için Çalıştır'a tıklayın.
    3. Yerleştirme kutusunu ayarlayın.
      1. Görevler'e tıklayın, Reseptör Izgarası Oluşturma'yı seçin ve ligand molekülünü tanımlamak için Seç'i seçin. Workspac e'de küçük molekülü seçin ve küçük molekül koordinatlarını ortalamış pembe bir yerleştirme kutusu görünecektir.
      2. Varsayılan ayarları koruyun, işi 1XD3_danshen_glide_grid olarak adlandırın ve ardından Çalıştır'ı tıklatın.
        NOT: 1XD3'te küçük molekül, protein ile kovalent bir bağ oluşturur. Küçük molekülü proteinden ayırmak için bu kovalent bağı çıkarmak gerekir. Aksi takdirde, reseptör ızgarası kurulum işlemi sırasında küçük molekül seçilemez.
  5. Moleküler yerleştirme gerçekleştirin.
    1. Görevler'e tıklayın ve Ligand Yerleştirme seçeneğini seçin. Reseptör Izgarasını seçin, Dosyadan'a tıklayın ve ardından Gözat'a tıklayın. 1XD3_danshen_glide_grid.zip dosyasını seçin ve Aç'ı tıklatın.
    2. Dosya olarak Ligandları Kullan'a tıklayın, ardından Gözat'a tıklayın. Dosyayı danshen_ligprep1, danshen_ligprep1-out. maegz dosyasını seçin ve ardından Aç'ı tıklatın.
    3. Ayarlar'a tıklayın ve SP olarak Precision'ı seçin, iş adını glidedock _SP danshen_UCHL3_ olarak değiştirin ve Çalıştır'a tıklayın.
  6. Yerleştirme sonuçlarını görüntüleyin.
    1. Dosya ve Yapıları İçe Aktar seçeneklerini tıklatın. Masaüstü'ne tıklayın ve danshen_CUHL3 yerleştirme klasörüne çift tıklayın.
    2. danshen_UCHL3_ glidedock _SP dosyasını çift tıklatın, danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz dosyasını tıklatın ve sonra Aç'ı tıklatın.
    3. Tablo seçeneğini tıklatın ve ardından yerleştirme puanı altında puanı görüntüleyin.
  7. Danshensu ve UCHL3 etkileşimlerini görselleştirin.
    1. danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz dosyasına çift tıklayın ve Maestro'da açın. Giriş listesinde, Shift tuşunu basılı tutun ve aynı anda danshensu ve proteini seçin.
    2. Yeni bir yapı oluşturmak için sağ tıklayın ve Birleştir'i seçin. Yeni yapıyı seçin, sağ tıklayın, Dışarı Aktar'ı seçin, ardından Yapılar'ı tıklatın, dosyayı danshensu_UCHL3 adlandırın ve .pdb biçiminde dışa aktarın.
    3. Panelde birleştirme yapısını seçin, Görevler'i tıklatın, 2B çiziciyi seçin ve danshensu ile UCHL3 arasındaki etkileşimin 2B yapı resmini elde edin.
    4. danshensu_UCHL3.pdb dosyasını pymol yazılımına aktarın ve Maestro'dan elde edilen 2B yapıya dayalı olarak görselleştirin.

3. Protein UCHL3'ün saflaştırılması

  1. pHUE-UCHL3 prokaryotik ekspresyon plazmidinin yapısı
    1. NCBI'den (isform2) rekombinant protein UCHL3 geninin kodlama dizisini elde edin. Elde edilen gen fragmanını homolog rekombinasyon yoluyla pHUE-10HIS vektörüne entegre edin ve onu DH5α yetkin hücrelere dönüştürün. İstenen yapıyı elde etmek için plazmit DNA'sını çıkarın.
  2. Rekombinant proteinlerin indüksiyonu ve saflaştırılması
    1. Bakteri kültürü:
      1. Rekombinant plazmitleri BL21 (DE3) yetkin hücrelere dönüştürün ve bunları ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) agar plakalarına yayın. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      2. Tek kolonileri seçin, bunları 50 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 12 mL sıvı LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
    2. Dönüşüm ve tümevarım
      1. Gece boyunca bakteri kültürünü taze bir ortam kullanarak% 2'ye seyreltin. OD600 0.4-0.6'ya ulaştığında, 12 saat boyunca 16 ° C'de düşük sıcaklıkta indüksiyon için 0.4 mM'lik bir nihai konsantrasyona izopropil-beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin.
    3. Bakteri kültürünün toplanması
      1. Bakteri kültürünü steril santrifüj tüplerine aktarın ve 2200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve koruma için suşları -80 °C'de saklayın.
    4. Sonikasyon
      1. Suşu, Tampon 1'in (50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA) 25 mL'sinde (toplanan bakteri kültürünün 1 / 20'si) yeniden süspanse edin. Aşağıdaki koşullar altında bakteriyel sonikasyon gerçekleştirin: 4 saniye açık, 6 saniye kapalı, enerji %60'a ayarlanmış, 15 dakika. % 1 Triton X-100 ekleyin ve 4 ° C'de 30-60 dakika boyunca parçalayın.
    5. Süpernatan ve peletin ayrılması
      1. Numuneyi 9000 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve 0,45 μm'lik bir membran filtreden süzün. Giriş olarak 50 μL süpernatan ayırın.
      2. Peleti Tampon 1'de tekrar süspanse edin, uygun miktarda 5x numune tamponu (%25 1M Tris-HCl [pH 6.8], %10 sodyum dodesil sülfat, %0.5 bromofenol mavisi, %41.67 gliserol ve %10 DL-ditiyotreitol) ekleyin ve 100 °C'de 10 dakika kaynatın.
  3. Protein saflaştırma
    1. Kolon dengeleme
      1. Kolona 1 mL NiNTA nikel reçinesi yükleyin, 10 dakika oturmasına izin verin, ardından kolonu 10 mM, 500 mM ve 10 mM imidazol içeren 5 kolon hacmi tampon 2 (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl) ile sırayla dengeleyin.
      2. Kolonun duvarı boyunca 5 mM imidazol çözeltisinden 5 mL (yaklaşık 10 sütun hacmi) eklemek için bir pipet kullanın. Akış hızını kontrol etmeden bu işlemi yapın.
      3. Sıvı, ambalaj malzemesini kapladığında ve neredeyse boşaldığında, dengeleme için sırayla 500 mM imidazol çözeltisinden 5 sütun hacmi ve 10 mM imidazol çözeltisi ekleyin. Kalan 10 mM imidazol çözeltisi sadece ambalaj malzemesini kapladığında, dengelemeyi durdurmak için akış kontrol cihazını kapatın.
    2. Protein saflaştırma
      1. Filtrelenmiş protein süpernatanı, akış fraksiyonunu toplayarak 0,5 mL/dk (damla başına <15 s) akış hızında kolondan geçirin. 0,5 M NaCl ile birlikte Tampon 2 kullanarak 10 mM, 30 mM, 50 mM ve 100 mM imidazollük bir konsantrasyon gradyanı hazırlayın.
      2. Akış hızını kontrol etmeden kolonun duvarı boyunca yaklaşık 5 kolon hacmi çözelti eklemek için bir pipet kullanarak, düşük ila yüksek imidazol konsantrasyonlarından sırayla elute edin. Elüatı temiz 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve tüp başına 1 mL akış elde edin.
      3. Beş tüp topladıktan sonra, 1 μL Bradford tamponu ile reaksiyona sokmak için her tüpten 1 μL akış alın. Reaksiyon mavi kalırsa, adımlara devam edin; Şeffaf hale gelirse, bu konsantrasyonda elüsyonu durdurun ve bir sonrakine geçin.
      4. 100 mM imidazol ile elüten sonra, akış hızını kontrol etmeden veya elüatı toplamadan 10 kolon hacmi 0.5 M NaCl ile yıkayın.
      5. Son olarak, 500 mM imidazol (damla başına <15 s) ile elüte edin. Bir pipet kullanarak, yukarıda belirtilen yavaş elüsyon oranını koruyarak kolona 1 mL çözelti ekleyin. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak 1 mL elüat toplayın ve bu işlemi 10 kez tekrarlayın.
    3. Saflaştırılmış proteini Coomassie Brilliant Blue boyama kullanarak değerlendirin.
      1. Her gruptan 10 μL alarak ve uygun 5x numune tamponunu ekleyerek, ardından 5 dakika boyunca 100 °C'de ısıtarak önceden elde edilen pelet, ön saflaştırma süpernatantı ve toplanan 10 protein tüpünü ölçün.
      2. Sığır serum albümini (BSA) standart çözeltisini 1 mg / mL, 500 μg / mL ve 100 μg / mL'de hazırlayın. Ardından uygun 5x numune tamponunu ekleyin ve 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
      3. Numuneler üzerinde SDS-PAGE jel elektroforezi yapın, ardından jeli çıkarın ve gece boyunca düşük hızlı bir çalkalayıcı üzerinde Coomassie Brilliant Blue solüsyonunda oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
      4. Ertesi gün, jeli renk giderme için renk giderici bir solüsyona (%40 etanol, %10 asetik asit, %50H2O) aktarın ve gerektiği kadar hafif ısı uygulayın. Jel şeffaf hale geldikten sonra, saflaştırılmış proteini BSA seviyelerine göre ölçmek için bir geliştirme aracı altında gözlemleyin ve tek bir bant olup olmadığını kontrol ederek saflığı değerlendirin.
    4. Protein depolama: Proteini tüp başına 50 μL'lik mikrosantrifüj tüplerine alın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın.

4. UCHL3 aktivite testi (Ub-AMC testi)

  1. Protein hazırlama
    1. Proteini buz üzerinde çözdürün, numuneyi RT'de 1000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve BCA yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Tampon 1 kullanarak proteini 40 nM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
  2. Grupları ayarlama
    1. Tampon 1'i kontrol grubu ve UCHL3'ü deney grubu olarak belirleyin. 96 oyuklu bir plakada her bir numuneden 200 μL ekleyin ve grup başına 3 kopya oluşturun.
  3. Algılama
    1. Ölçümden hemen önce, her bir oyuğa hızlı bir şekilde Ub-AMC ekleyin ve 2-5 saniye kuvvetlice çalkalayın. Kullanılan Ub-AMC konsantrasyonu 250 nM'dir. 37 °C koşullarında 380 nm uyarma dalga boyunda ve 460 nm emisyon dalga boyunda OD değerlerini ölçün ve her 30 saniyede bir 10 dakikaya kadar okuma yapın.

5. HA-UB-VS (HA-UB-VS testi) ile UCHL3 aktivitesinin inhibisyon deneyi

  1. Protein hazırlama
    1. Proteini buz üzerinde çözdürün, numuneyi RT'de 1000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve BCA yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Proteini 10 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin.
  2. Küçük moleküllerin hazırlanması
    1. Danshensu'yu tartın ve yüksek saflıkta su kullanarak 5 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM ve 1 μM'ye gradyan halinde seyreltin.
  3. Grupları ayarlama
    1. Saf protein grubunu ve küçük moleküllü ilaçları olmayan grubu negatif kontrol grupları olarak ayarlayın. Pozitif kontrol grubu olarak PR619 (DUB inhibitörü) ve diğer grupları küçük moleküllü ilaç tedavi grupları olarak kullanın.
  4. Numune hazırlama
    1. Gruplandırmaya göre, ilaçla tedavi edilen her gruba karşılık gelen konsantrasyonlarda sırayla 9 μL UCHL3 ve 1 μL Dansensu ekleyin. Pozitif kontrol grubuna 1 μL PR619 (kullanımda 50 μM) ekleyin. Negatif kontrol grubunu telafi etmek için yüksek saflıkta su ve Tampon 1 kullanın.
    2. Girdap yaparak iyice karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyon örneklerini buz üzerine yerleştirin, 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona HA-Ub-VS ekleyin, girdaplama ile iyice karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    3. Uygun miktarda 5x numune tamponu ekleyin ve 100 °C'lik bir metal banyoda 10 dakika ısıtın. Numuneleri 5 dakika RT'ye koyun ve jelin üzerine yükleyin.

6. Batı lekesi

  1. SDS-PAGE jelin hazırlanması
    1. Bir dizi cam paneli ultra saf suyla durulayın. Plakaları sıkıştırma yuvasına, ardından şeffaf bir tahta üzerine yerleştirin. Ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca sızıntı kontrolü yapın.
    2. Ayırma yapıştırıcısını tutkal dağıtım tablosuna göre hazırlayın.
    3. Jel kasetinden yüksek saflıkta suyu dökün ve kalan suyu filtre kağıdı ile emdirin. Hazırlanan% 12 ayırma jelini hızlı ve eşit bir şekilde ekleyin. Daha sonra 1 mL izopropanol ekleyin ve jel katılaşana kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.
    4. Konsantre tutkalın üst katmanını tutkal dağıtım tablosuna göre hazırlayın.
    5. İzopropanolü ayırma jelinin üstünden çıkarın, 3 kez yüksek saflıkta suyla yıkayın ve filtre kağıdı ile kurulayın. Hazırlanan %3'lük istifleme jelini hızlıca ekleyin, 1.0 mm 15 delikli tarak yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika bekleyin.
      NOT: Tarağı tutkal yüzeyine dik tutun ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
  2. Elektroforez
    1. Tarağı dikey olarak çıkarın ve elektroforez aparatının iç haznesine yeterli miktarda çalışan tampon dökün, böylece sıvının numune kuyularını kapladığından emin olun.
    2. Protein işaretleyicisini ve hazırlanan deney örneklerini RT'ye yerleştirin, iyice girdap yapın ve kısaca santrifüjleyin. İlk sol taraftaki numune kuyucuğuna 3 μL protein markörü ekleyin, ardından sonraki her oyuğa 10 μL deneysel numune ekleyin.
    3. Elektroforez tankının dış haznesine uygun miktarda çalışma tamponu ekleyin, tankı kapağıyla kapatın ve güç kaynağını bağlayın. Güç kaynağının doğru şekilde bağlandığından emin olun.
    4. Güç kaynağını açın ve numuneler hatlara konsantre olana kadar voltajı 80 V'a ayarlayın, ardından ayırma jelinde ayırma başladığında voltajı 120 V'a yükseltin.
      NOT: İşlem sırasında alt kısımda kabarcık oluşmadığından emin olun. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, onları dışarı atmak için elektroforez cihazını bir tarafa eğin.
  3. Membrana transfer
    1. Jel kasetini açmak için plastik bir bıçak kullanın. Yönü işaretlemek için numune yüklemenin başladığı sol üstte bir köşeyi kesin. Jeli ve gerekli filtre kağıdını transfer tamponunda 1-2 dakika bekletin.
    2. Poliviniliden diflorür (PVDF) zarını hedef protein için gereken boyuta göre ölçün ve kesin. PVDF membranını 20 s ila 1 dakika boyunca metanol içinde bekleterek etkinleştirin, ardından jel ile transfer tamponuna daldırın.
    3. Transfer aparatına az miktarda transfer tamponu dökün ve yarı kuru transfer ünitesini ıslatmak için bir rulo kullanın. Bileşenleri aşağıdan yukarıya doğru şu sırayla düzenleyin: üç kat filtre kağıdı, jel, PVDF membran ve üç kat daha filtre kağıdı.
    4. Her katmanı yerleştirdikten sonra, kabarcıkları çıkarmak için silindiri kullanın. Kapağı transfer tamponu ile ıslatın ve ardından aparatın üzerini kapatın.
      NOT: Her katmanı tamamladıktan sonra küçük bir miktar ekleyerek yeterli miktarda transfer tamponunun mevcut olduğundan emin olun. Numunelerin yüklendiği jelin sol ve sağ taraflarını ayırt etmenin yanı sıra zarın önünü ve arkasını tanımlayarak işaretleri önceden hazırlayın. Her katman yerleştirildikten sonra, kabarcıkları çıkarmak için hafifçe yuvarlayın.
    5. Doğru polariteyi sağlayarak güç kaynağını açın. Akımı 190 mA'ya ayarlayın ve süreyi 45 dakikaya ayarlayın.
  4. Engelleme
    1. Bloke edici tampon olarak TBST'de (%1 Tween20) %5 yağsız kuru süt çözeltisi hazırlayın. PVDF membranını ön tarafı yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin, 10 mL bloke edici tampon dökün ve bloke etmek için RT'de düşük hızlı bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat hafifçe sallayın.
  5. Primer antikorun inkübasyonu
    1. Primer antikoru antikor solüsyonu ile hazırlayın1:1000'de ve yeni inkübasyon kutusuna 10 mL primer antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu 4 °C soğuk bir odaya yerleştirin ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde tutun.
  6. İkincil antikorun inkübasyonu
    1. Ertesi gün inkübasyon kutusunda birincil antikoru toplayın, daha sonra uygun TBST solüsyonunu ekleyin ve 5 dakika yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine koyun, 3 kez tekrarlayın.
    2. İkincil antikoru 1:5000'de% 5 süt çözeltisi ile hazırlayın. Nemli bir hibridizasyon kutusunun dibine 1 mL ikincil antikor bırakın. PVDF membranını, protein tarafı aşağı bakacak şekilde ikincil antikorun üzerine yerleştirin ve ardından RT'de düşük hızlı bir çalkalayıcı üzerinde 1.5 saat inkübe edin.
    3. Uygun TBST solüsyonu ekleyin ve 5 dakika yıkamak için bir çalkalayıcı üzerine koyun; 3 kez tekrarlayın.
  7. Şeritlerin açığa çıkarılması
    1. Eşit hacimlerde kemilüminesan reaktifler A ve B alın, çalkalayın ve iyice karıştırın. Çözeltiyi ışıktan koruyun.
    2. Geliştirilen solüsyonu PVDF membranına eşit şekilde uygulayın ve membranın solüsyonla düzgün bir şekilde kaplandığından emin olmak için hafifçe sallayın.
    3. Membranı jel görüntüleme sistemine yerleştirin ve maruz kalma süresini, maruz kalma sayısını ve diğer ilgili parametreleri ayarlayın.
      NOT: Geliştirici şeridi tamamen kaplamalı ve geliştirme karanlık bir ortamda olmalıdır.

Sonuçlar

UCHL3'ü etkili bir şekilde inhibe edebilen Salvia miltiorrhiza Bge'deki küçük molekülleri taramak için, TCMSP web sitesinden UCHL3 ile elde edilen küçük moleküller arasında moleküler yerleştirme gerçekleştirdik. Yerleştirme sonuçlarındaki ilk 30 küçük molekül ve puanları Tablo 1'de gösterilmektedir. Tüm küçük moleküller için yerleştirme sonuçları Ek Tablo 1'de sunulmuştur. Araştırma için Danshensu'yu temsili...

Tartışmalar

DUB'lar, ubikuitini substratlardan veya poliubikuitin zincirlerinden çıkararak tüm ubikuitin sisteminin homeostazını düzenlemede çok önemli bir rol oynar37. Son yıllarda bu enzimler ilaç geliştirme hedefleri olarak da oldukça dikkat çekmektedir13. Bununla birlikte, küçük moleküllü ilaç geliştirme sürecinde zorluklar vardır. Örneğin, on binlerce küçük molekül kütüphanesini içeren yüksek verimli tarama, yüksek...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Pekin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [hibe numarası 7244498] tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

Referanslar

  1. Ciechanover, A. The ubiquitin proteolytic system and pathogenesis of human diseases: A novel platform for mechanism-based drug targeting. Biochem Soc Trans. 31 (2), 474-481 (2003).
  2. Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by e1 enzymes: The apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 319-331 (2009).
  3. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (11), 755-764 (2009).
  4. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (10), 626-642 (2016).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: Structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Clague, M. J., et al. Deubiquitylases from genes to organism. Physiol Rev. 93 (3), 1289-1315 (2013).
  7. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: Deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (6), 338-352 (2019).
  8. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: Emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 17 (1), 57-78 (2018).
  9. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of deubiquitinase specificity and regulation. Annu Rev Biochem. 86, 159-192 (2017).
  10. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L., Rose, I. A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (4), 1783-1786 (1980).
  11. Abdul Rehman, S. A., et al. Mindy-1 is a member of an evolutionarily conserved and structurally distinct new family of deubiquitinating enzymes. Mol Cell. 63 (1), 146-155 (2016).
  12. Storer, A. C., Ménard, R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500 (1994).
  13. Lange, S. M., Armstrong, L. A., Kulathu, Y. Deubiquitinases: From mechanisms to their inhibition by small molecules. Mol Cell. 82 (1), 15-29 (2022).
  14. Ndubaku, C., Tsui, V. Inhibiting the deubiquitinating enzymes (dubs). J Med Chem. 58 (4), 1581-1595 (2015).
  15. Schauer, N. J., Magin, R. S., Liu, X., Doherty, L. M., Buhrlage, S. J. Advances in discovering deubiquitinating enzyme (dub) inhibitors. J Med Chem. 63 (6), 2731-2750 (2020).
  16. Magin, R. S., et al. Small molecules as tools for functional assessment of deubiquitinating enzyme function. Cell Chem Biol. 28 (7), 1090-1100 (2021).
  17. Dang, L. C., Melandri, F. D., Stein, R. L. Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin c-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37 (7), 1868-1879 (1998).
  18. Li, Y. T., et al. New semi-synthesis of ubiquitin c-terminal conjugate with 7-amino-4-methylcoumarin. J Pept Sci. 20 (2), 102-107 (2014).
  19. Feng, X., et al. Ubiquitination of UVRAG by SMURF1 promotes autophagosome maturation and inhibits hepatocellular carcinoma growth. Autophagy. 15 (7), 1130-1149 (2019).
  20. Qin, X., et al. Identification of an autoinhibitory, mitophagy-inducing peptide derived from the transmembrane domain of USP30. Autophagy. 18 (9), 2178-2197 (2022).
  21. Borodovsky, A., et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  22. Ovaa, H. Active-site directed probes to report enzymatic action in the ubiquitin proteasome system. Nat Rev Cancer. 7 (8), 613-620 (2007).
  23. Ekkebus, R., Flierman, D., Geurink, P. P., Ovaa, H. Catching a dub in the act: Novel ubiquitin-based active site-directed probes. Curr Opin Chem Biol. 23, 63-70 (2014).
  24. D'arcy, P., et al. Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy. Nat Med. 17 (12), 1636-1640 (2011).
  25. Sucher, N. J. The application of Chinese medicine to novel drug discovery. Expert Opin DrugDiscov. 8 (1), 21-34 (2013).
  26. Jung, I., Kim, H., Moon, S., Lee, H., Kim, B. Overview of salvia miltiorrhiza as a potential therapeutic agent for various diseases: An update on efficacy and mechanisms of action. Antioxidants (Basel). 9 (9), 857 (2020).
  27. Wang, Z., Peters, R. J. Tanshinones: Leading the way into lamiaceae labdane-related diterpenoid biosynthesis. Curr Opin Plant Biol. 66, 102189 (2022).
  28. Bai, M., et al. Astrocytes and microglia-targeted danshensu liposomes enhance the therapeutic effects on cerebral ischemia-reperfusion injury. J Control Release. 364, 473-489 (2023).
  29. Zhang, H., et al. Salvianolic acid a protects RPE cells against oxidative stress through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Free Radic Biol Med. 69, 219-228 (2014).
  30. Wang, R., et al. Danshensu inhibits sars-cov-2 by targeting its main protease as a specific covalent inhibitor and discovery of bifunctional compounds eliciting antiviral and anti-inflammatory activity. Int J Biol Macromol. 257 (Pt 2), 128623 (2024).
  31. Misaghi, S., et al. Structure of the ubiquitin hydrolase UCH-L3 complexed with a suicide substrate. J Biol Chem. 280 (2), 1512-1520 (2005).
  32. Wing, S. S. Deubiquitinating enzymes--the importance of driving in reverse along the ubiquitin-proteasome pathway. Int J Biochem Cell Biol. 35 (5), 590-605 (2003).
  33. Samy, M. A., Abd El Fatah, N. M., Yahia, S. E., Arafa, R. K. Friend or foe: UCHL3 mediated carcinogenesis and current approaches in small molecule inhibitors' development. Curr Med Chem. 28 (42), 8782-8799 (2021).
  34. Hafez, N., Modather El-Awadly, Z., Arafa, R. K. UCH-L3 structure and function: Insights about a promising drug target. Eur J Med Chem. 227, 113970 (2022).
  35. Song, Z., et al. A novel UCHL(3) inhibitor, perifosine, enhances PARP inhibitor cytotoxicity through inhibition of homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Cell Death Dis. 10 (3), 398 (2019).
  36. Hirayama, K., Aoki, S., Nishikawa, K., Matsumoto, T., Wada, K. Identification of novel chemical inhibitors for ubiquitin c-terminal hydrolase-L3 by virtual screening. Bioorg Med Chem. 15 (21), 6810-6818 (2007).
  37. Nijman, S. M., et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell. 123 (5), 773-786 (2005).
  38. Guo, M., et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 12 (4), 1723-1739 (2022).
  39. Chavanieu, A., Pugnière, M. Developments in spr fragment screening. Expert Opin Drug Discov. 11 (5), 489-499 (2016).
  40. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  41. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  42. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
  43. Fan, Z., Wang, S., Xu, C., Yang, J., Cui, B. Mechanisms of action of fu fang gang liu liquid in treating condyloma acuminatum by network pharmacology and experimental validation. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 128 (2023).
  44. Tirat, A., et al. Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2. Anal Biochem. 343 (2), 244-255 (2005).
  45. Hassiepen, U., et al. A sensitive fluorescence intensity assay for deubiquitinating proteases using ubiquitin-rhodamine110-glycine as substrate. Anal Biochem. 371 (2), 201-207 (2007).
  46. Chan, W. C., et al. Accelerating inhibitor discovery for deubiquitinating enzymes. Nat Commun. 14 (1), 686 (2023).
  47. Haj-Yahya, N., et al. Dehydroalanine-based diubiquitin activity probes. Org Lett. 16 (2), 540-543 (2014).
  48. Li, G., Liang, Q., Gong, P., Tencer, A. H., Zhuang, Z. Activity-based diubiquitin probes for elucidating the linkage specificity of deubiquitinating enzymes. Chem Commun (Camb). 50 (2), 216-218 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 213Deubikitinating EnzimlerMolek ler Yerle tirmeK k Molek l nhibit rleriDanshensun Vitro ValidasyonAktivite nhibisyon DeneyleriUb AMCHA Ub VSBa lanma AfinitesiTerap tik la larUbikitinasyon Homeostaz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır