JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, verimli bir lahana mezofil protoplast sistemini tanımlar. Çeşitli oksijen eksikliği tedavileri test edildi ve sistem, Brassicaceae sebzelerinde taşkın toleransının genetik ve moleküler mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştıran, hipoksiye duyarlı genlerin yüksek bir aktivasyonunu gösterdi.

Özet

İklim değişikliği daha yoğun yağış getirdiğinden, önemli bir Brassicaceae sebzesi olan lahana, sel kaynaklı hipoksi stresi nedeniyle önemli verim kayıplarıyla karşı karşıyadır. Lahanalarda taşkın tolerans mekanizmalarını belirlemek için, lahanaların dönüşüm-inatçı doğasının üstesinden gelmek için genetik fonksiyonel çalışmalar için çok yönlü bir platforma ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, bir lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi ve buna karşılık gelen bir protoplast hipoksi indüksiyon protokolü geliştirilmiştir. Bu protokol, optimize edilmiş enzimatik koşullar kullanılarak %40'ı aşan bir transfeksiyon verimliliği ile lahana yapraklarından yüksek verim ve protoplast izolasyonu bütünlüğü elde etti. Tedavilerden önce potansiyel hipoksik etkiyi hafifletmek için, çözünmüş oksijen seviyelerini artırmak için W5 çözeltisi oksijen gazı ile köpürtüldü. EC-Oksiras, OksiFlor, sodyum sülfit ve bir oksijen emici paket dahil olmak üzere oksijen seviyelerini ayarlamak ve fizyolojik oksijen atma işlemleri için çeşitli kimyasallar test edildi. Çift lusiferaz deneyleri, anaerobik solunum yanıtı genleri BoADH1 ve BoSUS1L'nin promotörlerinin, hipoksi tedavilerinden sonra lahana protoplastlarında aktive edildiğini ve oksijen emici paket ile tedaviden sonra gözlenen en yüksek indüksiyon seviyesi olduğunu gösterdi. Özetle, hipoksi tedavisi ile birleştirilen lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi, verimli ve kullanışlı bir platform göstermektedir. Bu platform, lahanalarda hipoksi tepkileri ile ilişkili gen fonksiyonu ve moleküler mekanizmaların çalışmasını kolaylaştırabilir.

Giriş

Küresel iklim değişikliği, dünya çapında giderek daha kritik bir sorun olarak ortaya çıkan selleri daha da kötüleştirdi. Son yıllarda, sel olaylarının sıklığında artış eğilimi görülmüş ve bu da önemli mahsul kayıplarına neden olmuştur 1,2. Önemli küresel öneme sahip bir sebze olan lahana (Brassica oleracea var. capitata L.), yoğun yağışların olumsuz etkilerine karşı hassastır ve aşırı hava olayları karşısında sürdürülebilir üretimi sağlamak için sele dayanıklı lahana çeşitlerinin geliştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, lahanada taşkın stresi ile ilişkili moleküler mekanizmaları anlamak, bu zorluğun üstesinden gelmek için çok önemlidir.

Batık koşullar altındaki bitkilerde gen düzenleme mekanizmalarını anlamak için, transgenik hatlar genetik fonksiyonel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, yüksek maliyetler, zaman yoğun dönüşüm ve alt kültür süreçlerinin yanı sıra birçok mahsul türünde düşük dönüşüm verimlilikleri ile kısıtlanmakta ve alternatif metodolojilerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Protoplast bazlı geçici ekspresyon sistemleri, bitki moleküler araştırmalarında çok yönlü ve verimli bir alternatif olarak yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu sistemler, promotör aktivitesi, çevresel ipuçlarına yanıt olarak sinyal yolları, protein-protein veya protein-DNA etkileşimleri ve hücre altı lokalizasyonu3 ile ilgili araştırmaları kolaylaştırır. Protoplast geçici ekspresyon sistemlerinin kurulması sadece model bitkilerde 4,5 değil, aynı zamanda şeker kamışı6, karanfil7, Phalaenopsis orkideleri8 ve patlıcan9 gibi ekonomik açıdan önemli mahsullerde de rapor edilmiştir. Ayrıca, bu sistemler Camellia oleifera10ve Populus trichocarpa11 dahil olmak üzere odunsu bitkilerde başarıyla uygulanmıştır. Bununla birlikte, batırma kaynaklı hipoksi stresi altında yapraklı sebzeleri incelemek için protoplast sistemlerinin uygulanmasına yönelik protokoller sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışmada, bir lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi kullanarak yapraklı sebzelerde hipoksi tepkilerini incelemekle ilgilenenler için entegre bir protokol geliştirilmiştir.

Hücresel düzeyde batırma ile indüklenen hipoksi tepkisini gerçekleştirmek için, hipoksik ortamları simüle etmek için önceki çalışmalarda çeşitli oksijen temizleme metodolojileri kullanılmıştır. Bunlar arasında EC-Oxyrase, OxyFluor, sodyum sülfit ve oksijen tüketen torbaların kullanımı yer alır. EC-Oksirase tipik olarak insan hücre hatlarında12 ve Arabidopsis protoplastlarında 13 anaerobik tedavi için kullanılır. OxyFluor'un canlı hücreli floresan görüntüleme sırasında reaktif oksijen türlerinin neden olduğu fotobleaching'i azaltmada etkili olduğu bulunmuştur14,15. Sodyum sülfit, nematodların16 anaerobik tedavisinde ve daha yakın zamanda pirinç protoplastlarında, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deneyleri17 gibi tekniklerle birlikte kullanılmıştır. Esas olarak anaerobik bakteri kültürü18 için kullanılan oksijen emici paketler, anaerobik koşullar19 altında mısır protoplastlarında ZmPORB1 promotörlerinin aktivasyonunu indüklemede de etkinlik göstermiştir.

Bu çalışma, lahana protoplast izolasyonu ve geçici ekspresyonu için sağlam bir boru hattı oluşturmayı amaçlamaktadır. Daha sonra, çeşitli oksijen ayarlama tedavilerinin etkinliği, çift lusiferaz tahlilleri kullanılarak anaerobik yanıt genlerinin promotör aktivitesi değerlendirilerek değerlendirildi. Bu çalışmada geliştirilen protokolün, Brassica sistemlerinde batırma veya hipoksi stresi ile ilgili gelecekteki araştırmalar için değerli olması beklenmektedir.

Protokol

Bu çalışmada iki ticari lahana (B. oleracea var. capitata) çeşidi kullanılmıştır: 'Fuyudori' ve '228'. Protokol iş akışının grafiksel bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Lahana fidelerinin hazırlanması

  1. Ticari bitki substratı kullanarak 'Fuyudori' ve '228' lahana tohumlarını, 48 oyuklu tapa tepsilerinden (D 49 cm x G 28 cm x Y 5 cm) oluşan yuvarlak kare şekilli deliklere (D 4,5 cm x Y 4,5 cm) ekin. Tohumları yetiştirme ortamının yaklaşık 1 cm derinliğine gömün.
  2. Lahana fidelerini 22 °C'de 16/8 saat aydınlık-karanlık döngüsü ile bir yetiştirme odasında yetiştirin. Işık fazı sırasında 100 μmol m-2·s-1 (beyaz floresan tüp) ışık yoğunluğunu koruyun.
  3. 2-3 haftalık büyümeden sonra, daha fazla mezofil protoplast izolasyonu için 2 yapraklı aşamada lahana fideleri kullanın.
    NOT: Lahana fidelerinin önerilen boyutu, ikinci gerçek yaprağın tamamen genişlediği, ancak üçüncü gerçek yaprağın genişlemediği ve uzunluğunun 1 cm'den kısa olduğu 2 yapraklı bir aşamadır (Şekil 2A). Lahana fidelerinin gelişim aşamalarını senkronize etmek için, 'Fuyudori' tohumlarının farklı büyüme oranları nedeniyle '228' tohumlarından yaklaşık 2 gün önce ekilmesi gerekir. Bu ayarlama, istenen aşamada lahana bitkileri arasında homojen büyüme ve olgunluk sağlar.

2. Lahana protoplastları izolasyonu

  1. Her protoplast izolasyonundan önce 12.5 mL enzim çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın.
    1. 55 ° C'de 10 mM MES (pH 5.7) ve 0.6 M mannitol içeren bir çözeltiyi önceden ısıtın. % 1.5 Selülaz R10 ve% 0.75 Makrozyme R10 ekledikten sonra çözeltiyi 55 ° C'de 10 dakika ısıtmaya devam edin.
    2. Enzim çözeltisi oda sıcaklığına (25 ° C) soğuduktan sonra, 10 mMCaCl2 ve% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Filtre: Hazırlanan enzim çözeltisini 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak 9 cm'lik bir Petri kabına sterilize edin.
      NOT: Çözeltinin önceden ısıtılması enzim çözünürlüğünü arttırır ve proteazı inaktive eder. Sindirim etkileri, farklı selülaz enzim türlerine bağlı olarak değişir. Selülaz R10 ve Makrozim R10 kombinasyonu lahana protoplast izolasyonu için uygundur.
  2. Yeni genişletilmiş ikinci gerçek yaprakları beş ila sekiz lahana fidesinden toplayın ve keskin bir tıraş bıçağı kullanarak 0,5-1,0 mm'lik şeritler halinde dilimleyin. Yaprak şeritlerini hemen taze hazırlanmış enzim çözeltisine aktarın.
    NOT: Lahanadan sağlıklı ve belirlenmiş yaprakların uygun aşamada seçilmesi çok önemlidir. 2 yapraklı aşamada lahana fidelerinden yeni genişletilen ikinci gerçek yapraklar, en yüksek protoplast izolasyon verimliliğini sağlar. Aşırı olgun bitkiler, kotiledonlar veya yaşlı yapraklar protoplast izolasyonu için önerilmez. Beş ila on iki iyi genleşmiş gerçek yaprak, 12.5 mL enzim çözeltisinde başarılı bir şekilde lahana protoplastları verebilir. Protoplast izolasyonu için gereken yaprak sayısı, ihtiyaç duyulan istenen protoplast miktarına bağlıdır. Tipik olarak, beş ila sekiz yapraktan elde edilen protoplastlar, sonraki deneysel prosedürler için yeterlidir.
  3. Karanlıkta 30 dakika boyunca vakum sızmasından sonra (Şekil 2B), lahana yaprağı şeritlerini enzim çözeltisine (Şekil 2C) karanlıkta oda sıcaklığında 4-16 saat daha daldırın.
    NOT: Enzim sindirim süresi lahana çeşitleri arasında farklılık gösterebilir ve spesifik genotipe göre optimize edilmelidir. Örneğin, 'Fuyudori', 'Fuyudori'nin daha kalın yaprakları nedeniyle '228'e (4 saat) kıyasla daha uzun bir sindirim süresi (16 saat) gerektirir.
  4. Protoplast içeren çözeltiyi, 2 mM MES (pH 5.7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl ve 5 mM glikozdan oluşan eşit hacimde W5 çözeltisi ile seyreltin (hazırlık için Tablo 1'e bakınız), enzimatik sindirimi durdurmak için.
  5. Protoplast süspansiyonunu hafifçe döndürerek veya bir orbital çalkalayıcı kullanarak serbest bırakın. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe süzün.
    NOT: İzole edilmiş protoplastlar 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçebilirken, sindirilmemiş bitki artıkları süzgeç tarafından tutulur ve daha sonra süspansiyondan çıkarılır. Hücre süzgeçleri yıkandıktan sonra tekrar kullanılabilir ve %75 etanol içinde saklanabilir, ancak kullanmadan önce artık etanolü çıkarmak için hücre süzgeçlerini W5 çözeltisi ile tamamen durulamak gerekir.
  6. Protoplast çözeltisini 150 x g ile 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletlenmiş protoplastları, yaklaşık 1 mL·s-1 akış hızında konik borunun duvarı boyunca 10 mL W5 çözeltisi ekleyerek nazikçe yıkayın. Tüpü 150 x g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin ve enzim çözeltisinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için bu yıkama prosedürünü tekrarlayın.
  7. Protoplastları W5 solüsyonunda tekrar süspanse edin ve 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Buz inkübasyonundan sonra, tüm süpernatan çıkarılana kadar süpernatanı bir seferde 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.
  8. Protoplastları, 4 mM MES (pH 5.7), 0.4 M mannitol ve 15 mMMgCl2'den oluşan buzla soğutulmuş bir MMG çözeltisinde yeniden süspanse edin (hazırlık için Tablo 1'e bakınız).
  9. Protoplast konsantrasyonunu bir hemositometre ile ölçün ve MMG çözeltisi kullanarak nihai konsantrasyonu 4 x 105 protoplast · mL-1 olarak ayarlayın.

3. Protoplast transfeksiyonu

  1. Toplam 10 μL plazmid (5-10 μg) (Ek Dosya 1) hacmini 100 μL protoplast (4 x 104 protoplast) ile karıştırın ve 10 dakika buz üzerine koyun.
    NOT: Transfeksiyon dereceli plazmid saflaştırması için, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir plazmit kiti kullanılır. Yaklaşık 4 x 104 protoplastlar tipik olarak bir çift lusiferaz raportör testinde kullanılır. Daha büyük ölçekli deneyler için, transfeksiyon için daha yüksek miktarda protoplast mevcuttur. Spesifik olarak, 10 μg plazmit ile transfekte edilen yaklaşık 2 x10 5 protoplast, %30 ila %40 arasında değişen kanıtlanmış bir transfeksiyon verimliliği sergiler.
  2. Protoplast çözeltisine% 40 Polietilen Glikol 4000 (PEG4000), 0.1 M CaCl2 ve 0.2 M mannitol içeren eşit hacimde (110 μL) taze hazırlanmış PEG çözeltisi (hazırlık için Tablo 1'e bakınız) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  3. Protoplast karışımını oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu sonlandırmak için 440 μL W5 çözeltisi ekleyin.
  4. Transfekte edilen protoplastları 150 x g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti 750 μL oksijenle zenginleştirilmiş W5 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş protoplastları% 1 BSA ile önceden kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
    NOT: Hücre inkübasyonu için kullanılan W5 çözeltisi, 5 dakika boyunca bir hava taşına bağlı bir oksijen konsantratörü (~%90 oksijen) kullanılarak oksijenle köpürtülmelidir (Şekil 2D). Bu oksijenasyon işlemini takiben, W5 çözeltisindeki nihai çözünmüş oksijen konsantrasyonu 7.84 mg· L-1 ± 0.05 mg· L-1 ila 29.18 mg · L-1 ± 0.43 mg· L-1, çözünmüş oksijen ölçer ile ölçüldüğü gibi. Transfekte edilmiş protoplastın yeniden süspansiyonu için W5 çözeltisinin hacmi, kullanılan doku hücre kültürü plakasının tipine bağlıdır. 12 oyuklu veya 24 oyuklu hücre kültürü plakaları için, oyuklardaki daha derin derinlik nedeniyle inkübasyon sırasında hipoksi stresini azaltmak için W5 çözeltisinin hacminin azaltılması tavsiye edilir. BSA kaplaması için, kültür plakasının her bir oyuğuna 1 mL %1 BSA çözeltisi verildi ve bu çözeltinin kuyucukları 10 saniye kaplamasına izin verildi. BSA çözeltisi daha sonra her bir kuyucuktan atıldı ve kuyucuklar daha sonra W5 çözeltisi ile yeniden dolduruldu. Bu prosedür, BSA kullanarak geçici bir yapışmayan yüzey oluşturmayı ve sonraki deneysel adımlar sırasında protoplastların kültür plakasının plastik yüzeyine yapışmasını etkili bir şekilde önlemeyi amaçladı.

4. Lahana protoplastlarında hipoksi tedavisi

  1. Protoplast transfeksiyonundan hemen sonra kimyasal veya fiziksel olarak indüklenen hipoksi tedavileri yapın.
    NOT: Protoplast transfeksiyonundan hemen sonra hipoksi tedavisinin uygulanması önerilir. Protoplastların uzun süreli inkübasyonu, sonraki hipoksi yanıtını azaltabilir.
    1. Lahana protoplastlarında kimyasal olarak indüklenen hipoksi için, W5 protoplast çözeltisine OxyFluor, EC-Oxyrase ve sodyum sülfit ekleyin.
      NOT: W5'te 0.6 birim · mL-1 EC-oksiraz, 0.6 birim · mL-1 OxyFluor ve 1 g · mL-1 sodyum sülfit kullanılması, BoADH1 ve BoSUS1L promotörü indükleyebilen test edilmiş koşullardı (Şekil 3A) incelenen iki lahana çeşidinde protoplast bütünlüğüne düşük hasarla.
    2. Oksijen tüketen torba kaynaklı hipoksi için, hipoksik bir ortam oluşturmak için 3,5 L'lik anaerobik bir kavanoza iki oksijen emici paket yerleştirin.
  2. Hipoksi ile muamele edilen protoplastları 4 ° C'de 2 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyerek hasat edin. Toplanan protoplastları sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve sonraki tahliller için -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.

5. Çift lusiferaz testi

  1. Çift lusiferaz raportör tahlilini, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.
    1. Lahana protoplastlarını 50 μL 1x pasif lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve 10 saniye boyunca girdap yapın.
    2. Bozulmuş protoplastları buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve süpernatanı 10.000 x g'da 10 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjlemeden sonra toplayın.
    3. Mikroplakanın her bir oyuğuna 20 μL hücre lizatı ekleyin. Kuyucuklara 100 μL Lusiferaz tahlil reaktifi II dağıtın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak ateşböceği lusiferaz aktivitesini ölçün.
    4. Her bir oyuka ticari olarak temin edilebilen 100 μL tahlil reaktifi ekleyin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak Renilla lusiferaz aktivitesini ölçün.

Sonuçlar

Bu çalışma, lahana protoplastlarını kullanan geçici bir ifade sistemini başarıyla geliştirdi (iş akışı için Şekil 1'e bakın). Protoplastlar, selülaz/maerozim sindirimi ve koyu vakum infiltrasyonu kullanılarak ticari lahana çeşitleri 'Fuyudori' ve '228'den uygun büyüklükteki 2 ila 3 haftalık lahana gerçek yapraklarından (Şekil 2A) izole edildi (Şekil 2B,C)...

Tartışmalar

Bu protokol, iki ticari lahana çeşidinden protoplast izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yöntem sunar. Bu yöntemin etkinliği öncelikle iki kritik kalite kontrol parametresi ile değerlendirilir: canlı protoplastların verimi ve protoplast transfeksiyonunun verimliliği. Bu protokolün uygulanması, 4.00 x 106 protoplast·g-1· Her iki lahana çeşidinden mezofil dokusunun FW'si (Şekil 2E,F). Bu verim, pat...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rekabet çıkarı beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (MOST 111-2313-B-002-029- ve NSTC 112-2313-B-002-050-MY3) tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 için, deneysel simgeler BioRender.com'dan alınmıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)PhytoTech LabsM825For enzyme solution preparation
228 cabbage seedsTakii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical TubeSPL Life Sciences50050For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plateAlpha Plus16106For protoplast incubation
70 μm cell strainerSorfa SCS701For protoplast filtration
9-cm Petri dishAlpha Plus16001For enzymatic digestion
Anaerobic jarHIMEDIAAnaerobic Jar 3.5 LFor hypoxia treatment 
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chlorideJ.T.Baker131301For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10YakultFor enzyme solution preparation
DesiccatorTarsons 402030For vacuum infiltration
D-GlucoseBioshopGLU501For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meterThermo ScientificOrion Star A223For oxygen measurement
D-MannitolSigma-AldrichM1902For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960For Dual-luciferase reporter assay
EC-OxyraseOxyrase Inc.EC-0005For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seedsKobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifugeHitachiCR21GIIIFor protoplast harvest
Macerozyme R10 YakultFor enzyme solution preparation
Magnesium chlorideAlfa Aesar12315For MMG solution preparation
MicrocentrifugeHitachiCT15REFor protoplast harvest
MicroplateGreiner655075For Dual-luciferase reporter assay
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax MiniFor Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filterMerckSLGP033RSFor enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum PumpRocker Rocker 300For vacuum infiltration
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005For hypoxia treatment
Oxygen absorber packMitsubishi Gas Chemical CompanyAnaeroPack, MGCC1For hypoxia treatment
Oxygen concentratorUTMOST PERFECTAII-XFor oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrateKlasmann-DeilmannPotgrond H substrateFor cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi KitQIAGEN12145For purification of transfection-grade plasmid DNA 
Polyethylene Glycol 4000Fluka81240For protoplast transfection
Potassium chlorideJ.T.Baker304001For W5 solution preparation
Razor bladeGilletteFor cabbage leaf strips preparation
Sodium chlorideBioshopSOD002For W5 solution preparation
Sodium sulfiteSigma-AldrichS0505For hypoxia treatment
Water BathYihderBU-240DFor enzyme solution preparation

Referanslar

  1. Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021 (2016).
  2. Voesenek, L. a. C. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
  3. Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  4. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  5. Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  6. Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
  7. Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057 (2022).
  8. Lin, H. -. Y., Chen, J. -. C., Fang, S. -. C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
  9. Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303 (2022).
  10. Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885 (2023).
  11. Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908 (2012).
  12. Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
  13. Cho, H. -. Y., Chou, M. -. Y., Ho, H. -. Y., Chen, W. -. C., Shih, M. -. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863 (2022).
  14. Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892 (2016).
  15. Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
  16. Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
  17. Lin, C. -. C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229 (2023).
  18. Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
  19. Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Lahana Protoplast SistemiHipoksi ToleransBrassicaTa k n Kaynakl Hipoksi StresiGenetik Fonksiyonel al malarProtoplast zolasyonuTransfeksiyon Etkinli iz nm Oksijen D zeyleriAnaerobik Solunum Yan t GenleriBoADH1BoSUS1LOksijen Emici Paketift Lusiferaz DeneyleriGen Fonksiyon al malarMolek ler Mekanizmalar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır