Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir.

live

Speed

×

MEDIA_ELEMENT_ERROR: Format error

Preparation of Photo-Oxidized Outer Segment Tips and Fragments

Transkript

Politetrafloroetilen veya PTFE kaplı slaytları bir biyogüvenlik kabininde 10 dakika boyunca% 70 etanol içine daldırarak sterilize ederek başlayın. Slaytların steril 100 milimetrelik bir hücre kültürü kabında hava ile kurumasını bekleyin. Her slaytı 1 yeni 100 milimetrelik hücre kültürü kabına yerleştirin ve her dikdörtgene 200 mikrolitre serum içeren hücre kültürü ortamı ekleyin.

Ardından, ampul 20 dakika boyunca doğrudan slayta bakacak şekilde 100 milimetrelik hücre kültürü kabına elde taşınan 254 nanometre UV ışığı yerleştirin. Dış segmentlerin veya OS'nin donmuş alikotlarını 37 santigrat derecelik bir su banyosunda çözün. Ardından işletim sistemini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2.400G'de döndürün.

Bir pipet kullanarak biyogüvenlik kabinindeki süpernatantı derhal aspire edin ve işletim sistemini PBS'de yeniden askıya alın. Şimdi, ortamı slaytlardan aspire edin ve her slayt dikdörtgeninde mililitre PBS çözümü başına 2 x 10 ila 8. işletim sisteminin mililitre PBS çözümü başına 2 x 10 ila 8. işletim sisteminin 500 mikrolitresine kadar yerleştirin. Elde taşınan 254 nanometre UV ışığını, ampul 40 dakika boyunca doğrudan işletim sistemine bakacak şekilde hücre kültürü kabının üzerine yerleştirin.

OS-PBS çözeltisini 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın. Kaplanmış slaytın dikdörtgenini 200 ila 500 mikrolitre PBS ile yıkayın ve her yıkamayı mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Ardından, OS-PBS çözümünü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2.400G'de döndürün.

PBS'yi biyogüvenlik kabininde bir pipetter ile aspire edin ve peleti retinal pigment epiteli veya RPE kültürleri için kullanılmak üzere 500 mikrolitre standart ortamda yeniden askıya alın. Süspansiyonun 10 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Daha fazla hücre kültürü ortamı ile 50 ila 100 kez seyreltin ve işletim sistemini bir hemositometre ile sayın.

Foto-oksitlenmiş işletim sistemini veya OxOS süspansiyonunu, mililitre konsantrasyon başına 5,6 x 10 ila 7. işletim sisteminde standart bir RPE ortamına seyreltin. OS alımını ve lipofussin birikimini kolaylaştıran fagositoz köprüleme ligandları ekleyin. Daha sonra OxOS'u tek kullanımlık stoklara alın ve sıvı azotta tutturun.

Lipofussin birikimini indüklemek için RPE transwelllerine eklemeden önce dondurulmuş aliquot'u 45 mikrolitre hücre kültürü ortamında seyrelterek OxOS aliquot'ları çözün. Ardından, konfokal mikroskopta Lambda taramasını kullanarak OxOS emisyon spektrumunu ölçerek oksitlenmiş işletim sistemini karakterize edin. Konfokal görüntüleme, tedavi edilen OS'nin tedavi edilmeyen OS'ye kıyasla otofloresansı arttırdığını göstermiştir.

Daha Fazla Video Keşfet

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.