Başlamak için, deney için gereken kuyu sayısını hesaplayın. Ardından, uygun miktarda normal işletim sistemi örneğini çözün. Mililitre başına dört kez 10 ila altıncı arasında nihai bir işletim sistemi konsantrasyonu elde etmek için yeterli RPE ortamı ekleyin.
Apikal ortamı çıkarın ve uygun köprüleme ligandı konsantrasyonları ile mililitre başına altıncı OS'ye dört kez 10'luk 50 mikrolitre ekleyin. İşletim sistemi eklendikten sonra, örnekleri çeşitli zaman noktaları için inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hem hücreleri hem de süpernatan içeren üstteki OS'yi lize etmek için proteaz inhibitörleri ile 16.67 mikrolitre dört kez Laemmli numune tamponu ekleyin.
Bir P200 pipet kullanarak Transwell yüzeyini çizin ve birleştirilmiş hücre süpernattanı ile hücre lizatını birlikte toplayın. Vorteks ve iyice denatürasyon için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Rodopsinin batı lekesi, bozulmamış rodopsin bandının kontrol ve UAM yüklü RPE hücrelerinde ayırt edilemez olduğunu gösterdi.
Bununla birlikte, rodopsinin bölünme ürünleri UAM grubunda daha yüksekti ve bu da fagolizozomal sistemde hafif bir degradatif disfonksiyon olduğunu düşündürüyordu. GAPDH'nin eşit seviyeleri, kuyucuklar arasındaki hücre sayısının eşit olduğunu gösterir. Farklı rodopsin antikorları farklı bozunma fragmanlarını tanır.
4D2, lizozomal bozunmanın son adımlarına kadar bozulmamış olan rodopsinin son terminüsünü tanır. Buna karşılık, 1D4, fagolizozomal süreçte daha önce bozulan rodopsin'in C terminüsünü tanır.
