Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir.

live

Speed

×

MEDIA_ELEMENT_ERROR: Format error

Assessment of EGFP-Positive Fiber Electrical Activity, Cysteine Staining, and Signal Acquisition

Transkript

Florometri ölçümü için tüm edinme kurulum bileşenlerini açın. Ayrışmış kas liflerini içeren 35 milimetrelik cam tabanlı kabı mikroskop sahnesine yerleştirin. Kültür ortamını 1.000 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice çıkarın ve 2 mililitre oda sıcaklığında zil sesi çözeltisi ile değiştirin.

Mekanik veya motorlu bir manipülatör kullanarak, iki platin teli çanağın dibine dik olarak yerleştirin. Elektrot terminallerinin fiberin uzunlamasına eksenine göre hizalandığından ve fiberin uçlarından birkaç milimetre uzakta olduğundan emin olun. Çanağı döndürerek veya bağımsız bir mikro manipülatöre monte edilmişse her elektrodu hareket ettirerek elektrot konumlandırmasını ayarlayın.

İletilen ışığı açın ve 20 X'lik bir hedef kullanarak görüş alanındaki lifleri bulun. EGFP filtre küpünü ışık yoluna taşıyın. İletilen ışığı kapattıktan sonra, uzaktan kumandalı bir ışık deklanşörü kullanarak 488 nanometre uyarma ışığını etkinleştirin.

EGFP pozitif lifleri tanımlamak için, görüş alanının ortasında en parlak EGFP sinyaline sahip fiberleri ortalayın. Uyarma ışığını fiberin belirli bir alanına odaklamak için uyarma ışığı yoluna yerleştirilmiş bir diyafram kullanın. Bu, EGFP CaV1.1 sinyalinin maksimum olduğu sinyal alımını mümkün kılar.

Diyafram ışık yolu ile hizalamak için fiber konumunu mekanik sahne ile ayarlayın ve fiber XY konumunu saklayın. İlk kaydedilen lokalizasyona döndükten sonra, iki sıralı stimülasyon darbesinin süresini 1 milisaniyeye, genliği 20 volta ve darbelerin polaritesini dönüşümlü olarak ayarlayın. Ardından, iki sıralı darbeyi iletmek için manuel bir tetik anahtarı kullanın.

Stimülasyon sırasında, zıt kutupluluğun iki darbesine yanıt olarak iki eşmerkezli homojen lif kasılmasını gözlemleyin. Alternatif polarite darbeleriyle kasılma yoksa veya sadece bir konsantrik büzülme gözlenirse, lifleri deneyin geri kalanından atın. 2 mikrolitre 10 milimolar MTS 5 TAMRA çözeltisini doğrudan kabın içine ekleyin ve 1.000 mikrolitrelik pipetle hafifçe karıştırın.

Floresan tiol molekülünün enine tübül sistemi lümenine difüzyonuna izin vermek için dört ila beş dakika inkübe edin. Alan stimülasyonu yoluyla, 5 dakika boyunca her 1 saniyede bir 300 milisaniye boyunca 50 hertz hızında ardışık aksiyon potansiyeli trenlerini uyandırmak için bipolar tekrarlayan stimülasyonlar uygulayın. Lekeleme solüsyonunu 1.000 mikrolitrelik bir pipetle çanaktan çıkarın.

Ve 2 mililitre oda sıcaklığında zil çözeltisi ile değiştirin. Lekeli lifin boyama protokolünden en az 10 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. İki alternatif darbeyle lif sağlığını ve elektriksel aktiviteyi yeniden değerlendirdikten sonra, MTS 5 TAMRA filtre küpünü ışık yoluna taşıyın ve lifler üzerindeki lekelenmeyi görsel olarak doğrulamak için uzaktan kumandalı bir ışık deklanşörü ile 533 nanometre uyarma ışığını etkinleştirin.

Daha sonra, motorlu sahnede depolanan konumu kullanarak, fiberi MTS 5 TAMRA filtre küpü, diyafram ve 60X yağ daldırma hedefi ile alanın ortasına yerleştirin. Fiberin her iki ucundaki alan stimülasyon platin tellerini yeniden yönlendirdikten sonra, liflerin ana eksenindeki telleri düz bir çizgide hizalayın ve fiber merkezde olacak şekilde beş milimetre aralıklarla yerleştirin. Alma yazılımında, alma için kullanılacak protokolü seçin.

Bu adım yalnızca bilgisayarla kontrol edilir ve elektriksel stimülasyon ve ışık yolu deklanşör kontrolü için tüm aşağı akış aygıtlarını tetikler. Her protokol için, sinyal ağartmasını önlemek için toplam edinme süresini mümkün olduğunca en aza indirin, ancak bir taban çizgisini kaydetmek için ilk elektriksel stimülasyondan önce birkaç on milisaniye ışık aydınlatması ve sinyal alımına izin verin. Execute'a basarak protokolü çalıştırın.

Kaydedilen sinyal otomatik olarak ekranda görüntülenir. Sinyalin küçük genliği ve fiberin hızlı mekanik büzülmesi genellikle sinyalin çoğunu gizler ve bir hareket eseri gösterir. Sözleşmeye bağlı tepkileri en aza indirmek için kayıt çözeltisine 1 mikromolar 100 milimolar ve benzoil para toluen sülfonamid ekleyin ve fiber aktivasyonu nedeniyle S4 hareketlerinden kaynaklanan sinyali daha da ayırt edin.

Birkaç dakika sonra aynı protokolü ikinci kez çalıştırın. Hareket artefaktı şimdi kaldırıldı, ancak S4 hareketine karşılık gelen küçük bir floresan değişikliği kaldı. Herhangi bir lif veya döküntü içermeyen bir alandan sinyal almak için mekanik aşamayı kullanarak çanağı hafifçe hareket ettirin.

Arka plan floresansını kaydetmek için protokolü son kez çalıştırın. İzlemeleri dışa aktarın ve sinyali zamanın bir fonksiyonu olarak f 0 üzerinden delta f olarak ifade etmek için bir elektronik tablo programı kullanın ve gerekirse taban çizgisi düzeltmesi uygulayın. Bir EGFP CaV1.1 yapısını ifade eden disseke edilmiş ve ayrışmamış kasın iletilen ve floresan görüntülerinin örnekleri burada gösterilmiştir.

MTS 5 TAMRA boyamasından önce ve sonra bir EGFP CaV1.1 VS D3 yapısını eksprese eden bir kas lifinin temsili görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir. Bu boya ayrıca transfekte olmayan liflerin endojen sisteinlerini de boyar. Bir EGFP CaV1.1 VS D3 yapısının ve MTS 5 TAMRA boyamasının konfokal görüntüleri, kas lifinin enine tübül sistemi üzerinde CaV1.1 lokalizasyonunun karakteristik bir çift bant paterni göstermektedir.

İki uyarana yanıt olarak ve bir foto diyot ile ölçülen temsili florometrik kayıt burada gösterilmiştir. Her iki sinyal de minimum değerleriyle normalleştirilir ve kendi depolarizasyonlarına göre zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. Bu kayıtlar, yükselen fazın ve sinyalin zirveye ulaşma zamanının, fibere uygulanan her iki depolarizasyon için de benzer olduğunu göstermektedir.

Daha Fazla Video Keşfet

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.