Numune hazırlamaya başlamak için, keskin bir tıraş bıçağı kullanarak farmakolojik olarak işlenmiş Arabidopsis thaliana transgenik numunesinden gerçek yaprağı inceleyin. Gerçek yaprağı, abaksiyal tarafı yukarı bakacak şekilde bir damla suya bir cam slayt üzerine yerleştirin. Gerçek yaprağı hava kabarcığı olmayan bir kapak kayma ile yavaşça örtün.
Görüntüleme için, sarı floresan proteini veya YFP uyarımı için 514 nanometrelik bir lazer seçerek ışın yolunu ayarlayın. Yüksek lazer gücü kullanarak yüksek görüntü kalitesi elde edin. PMT veya HYD'yi açın ve YFP florofor spektrumuna göre üst ve alt emisyon bandı eşiklerini tanımlayın.
YFP sinyalini toplamak için 530 ila 570 nanometrelik bir algılama penceresi ayarlayın. İkinci rengin sıralı görüntüsü için ara düğmesine tıklayın ve yeni bir kanal ekleyin. İkinci aramada, kırmızı floresan proteini veya RFP uyarımı için 555 nanometrelik bir lazer seçin ve RFP sinyalini toplamak için 570 ila 630 nanometrelik bir algılama penceresi ayarlayın.
Stoma öncü hücrelerindeki hücre altı membran trafik aktivitesini görüntülemek için sistemde 63X, 1.2W çekirdekli bir lens seçin. Formatı 1024 x 1024 piksel görüntü boyutuyla başlatın, ardından iyi bir çözünürlük için yakınlaştırma faktörüne ve objektif ayarlarına göre optimize edin. Ardından, 400 hertz hızından başlayarak tarama kafasının hızını ayarlayın ve bunu örneklerin özel durumuna göre optimize edin.
Objektif merceği değiştirmeden ilgilenilen bir bölgeyi yakınlaştırmak için bir yakınlaştırma faktörü girin ve bunu deneyin özel ihtiyaçlarına göre optimize edin. Satır ortalaması, ortalama bir sonuç elde etmek için her bir X satırının kaç kez taranacağını ifade eder. Membran kaçakçılığı olaylarını görüntülemek için 2X çizgi ortalaması ile başlayın ve gerektiğinde optimize edin.
Zaman serisi yardımcı programını etkinleştirmek için alım modunda XYT tarama modunu seçin. Ardından, zaman aralığı altındaki zaman noktaları arasındaki bekleme süresini seçin. Çerçeveleri seçerek toplanacak çerçeve sayısını tanımlayın.
Tüm hücre içindeki membran trafiği olayıyla ilgili üç boyutlu bilgileri toplamak için maksimum yoğunluk projeksiyonu ile Z-yığını tarama modunu kullanın. Ardından, alım modunda XYZ tarama modunu seçin, ardından Z-stack yardımcı programı erişilebilir hale gelecektir. Z geniş seçeneğini seçin.
Tarama modunda, başlangıç ve bitiş düğmelerini kullanarak Z yığınının üst ve alt görüntülerini tanımlayın. Ardından, Z adım boyutuna tıklayarak Z adımının kalınlığını tanımlayın. Görüntüyü işlemek için, Confocal yazılımındaki birincil işlem sekmesine tıklayın.
En sol taraftaki projeleri aç sekmesinin altında, ilgili Z-stack dosyasını seçin. Ardından, işlem araçları adlı orta sekmede projeksiyon işlevini seçin. Yöntemin açılır panelinde maksimumu seçin ve uygula düğmesine tıklayın.
Açık projeler sekmesi altında bir Z-stack projeksiyon görüntüsü oluşturulacaktır. Videoyu zaman serisi görüntülerinden oluşturmak için, Fiji yazılımındaki dosya sekmesine tıklayın ve tüm zaman serisi görüntülerini doğru sırayla tek tek açmak için işlevi açın. Alternatif olarak, verileri doğru sırada açmak için görüntüleri J görüntüsüne sürükleyin.
Ardından, görüntü sekmesinde yığın işlevini bulun ve bir video oluşturmak için yığınlanacak görüntüleri seçin. Bittiğinde, dosyayı istediğiniz kare hızıyla avi formatında kaydedin. ERL1 promotörü ERL1 YFP taşıyan yedi günlük transgenik bitkilerin gerçek yaprağında, dağınık hücreler, ERL1 YFP'nin plazma zarını etiketlediği YFP sinyali ile vurgulandı.
ERL1'in endozomlara da lokalize olduğunu düşündüren çoklu noktasal sinyaller de gözlendi. RFP Ara7, hemen hemen tüm hücrelerde, bu hücrelerdeki multiveziküler cisimleri veya MVB'leri gösteren çoklu noktasal sinyalleri vurguladı. RFP Ara7, ERL1 YFP sinyali ile birleştiğinde, çoğu nokta üst üste bindi, bu da bazı ERL1 YFP moleküllerinin MVB'lere taşındığını düşündürdü.
ERL1 YFP ve MVB marker proteini RFP Ara7'yi taşıyan gerçek yaprakların zaman serileri, YFP etiketli endozomların stoma soy hücreleri içinde RFP Ara7 ile birlikte hareket ettiğini gösterdi. ERL1 YFP'nin multiveziküler cisimlere lokalize olduğunu doğruladı.
